低聚糖含量的测定

1. 低聚果糖(fructo-oligosaccharide，FOS)含量的测定(GB/T23528—2009)

1)原理

低聚果糖按结构可以分为蔗-果型低聚果糖和果-果低聚果糖。低聚果糖的成分包括蔗果三糖(GF2)、果果三糖(F3)、蔗果四糖(GF3)、果果四糖(F4)、蔗果五糖(GF4)、果果五糖(F5)、蔗果六糖(GF5)、果果六糖(F6)等。

低聚糖各组分用高效液相法分离并定量测定，以乙腈、水作流动相，在碳水化合物分析柱上糖的分离顺序是先单糖后双糖，先低聚糖后多糖，以示差折射检测器检测。根据保留时间用外标法或峰面积归一化法定量，以外标法为仲裁法。

2)仪器

①高效液相色谱仪(配有示差折光检测器或蒸发光散射检测器和柱恒温系统);

②流动相真空抽滤脱气装置及0.2μm或0.45μm微孔膜;

③色谱柱: 氨基柱;

④分析天平: 感量0.0001g;

⑤微量进样器: 10μL。

3)试剂

①水: 二次蒸馏水或超纯水(过0.45μm水系微孔膜);

②乙腈: 色谱纯;

③标准溶液: 葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖的标准品，分别用超纯水配成40mg/m L的水溶液。

4)操作步骤

(1)样品处理

称取适量的液体或固体样品(使各组分含量在0.4～40mg/m L范围内)，用超纯水定容至100m L，摇匀后，用0.45μm膜过滤(或12000r/min离心5min)，收集滤液，作为待测试样溶液。

(2)色谱条件

色谱柱: YWG-NH2柱，4.6mm×300mm;

柱温: 35℃;

流动相: 乙腈 水(体积比) =75 25;

流速: 1.0m L/min;

进样量: 5～10μL。

(3)标准曲线的绘制

将标准溶液在0.4～40mg/m L范围内配制6个不同浓度的标准液系列，分别进样后，以标准浓度对峰面积作标准曲线。在线性相关系数为0.9990以上，否则需调整浓度范围。

(4)样品测定

将试样进样，根据标样的保留时间定性样品中各种糖组分的色谱峰，根据样品的峰面积，以外标法或峰面积归一化法计算各种糖分的百分含量。

5)结果计算

(1)外标法

样品中各组分的百分含量:

式中: Xi——样品中组分i(葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖)占样品的百分含量，%;

Ai——样品中组分i的峰面积;

ms——标准样品中某组分糖标准品的质量，g;

Vs——标准样品稀释体积，m L;

As——标准样品中某组分糖标准品的峰面积;

m——样品的质量，g;

V——样品的稀释体积，m L。

样品中低聚果糖的百分含量:

FOS含量(%) =GF2含量+GF3含量+GF4含量+GF5含量

(2)峰面积归一化法

用峰面积归一化法计算各组分糖占样品的百分含量，因为所有组分均能出峰，各组分是同系物，其校正因子相同，按下式计算各组分糖的百分含量:

式中: Pi——样品中组分i占样品的百分含量，%;

Ai——样品中组分i的峰面积;

∑Ai——样品总所有成分峰面积的总和。

样品中低聚果糖的百分含量:

FOS(含量/%) =GF2含量+GF3含量+GF4含量+GF5含量

6)说明及注意事项

①以蔗糖为原料的低聚果糖有效成分仅包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)和蔗果六糖(GF5)。

②以菊芋、菊苣为原料的低聚果糖，其果果三糖(F3)、果果四糖(F4)、果果五糖(F5)、果果六糖(F6)的色谱峰分别包含于蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)、蔗果六糖(GF5)的色谱峰之中。

③由于果果三糖(F3)、果果四糖(F4)、果果五糖(F5)、果果六糖(F6)没有标样，以菊芋、菊苣为原料的低聚果糖计算含量时宜采用峰面积归一化法。

④低聚糖难得到纯品，因酶反应产物中除各种蔗果糖外，还残留下不少葡萄糖、果糖、蔗糖，或者麦芽糖。低聚糖尚无准确的定量方法，其原因是低聚糖分离的响应因子依赖于分子内部链的长短，故准确定量较难。

⑤如果无GF2、GF3、GF4、GF5标样，低聚果糖的定量采用间接法，即由测定的总糖中减去果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，所得的差值就是样品中低聚果糖的含量。

2.大豆低聚糖含量的测定(GB/T22491—2008)

1)原理

大豆低聚糖主要成分包括水苏糖(stachyose)、棉籽糖(raffinose)及蔗糖(sucrose)等。

试样用80%乙醇溶解后，经0.45μm滤膜过滤，采用反相键合相色谱测定，根据色谱峰保留时间定性，根据峰面积或峰高定量，各单体的含量之和为大豆低聚糖含量。

2)仪器

①高效液相色谱仪(附示差折光检测器)。

②分析天平: 感量0.0001g。

3)试剂

①乙腈: 色谱纯;

②80%乙醇溶液: 量取800m L无水乙醇加水稀释至1000m L;

③低聚糖标准溶液: 分别称取蔗糖、棉籽糖、水苏糖标准品(含量均应≥98%)各1.000g置于100m L容量瓶中，用80%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。每毫升溶液分别含蔗糖、棉籽糖、水苏糖10mg。经0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC分析用。

4)操作步骤

(1)色谱条件

色谱柱: Kromasil100氨基柱，25cm×4.6mm，或相同性质的填充柱;

流动相: 乙腈 水(体积比) =80 20;

流速: 1.0m L/min;

检测器: 示差折光检测器(RID);

色谱柱温度: 30℃;

检测器温度: 30℃;

进样量: 10μL。

(2)样品的制备

称取试样1.000g，加80%乙醇溶液溶解并稀释定容至100m L，混匀，经0.4545μm滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。

(3)测定

①标准曲线的绘制: 分别取低聚糖标准溶液1μL，2μL，3μL，4μL，5μL(相当于各低聚糖质量10μg，20μg，30μg，40μg，50μg)注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，测定各组分色谱峰面积(或峰高)，以标准糖质量对应峰面积(或峰高)作标准曲线，或用最小二乘法求回归方程。

②样品测定: 在相同的色谱分析条件下，取10μL试样溶液注入高效液相色谱仪，测定各组分色谱峰面积(或峰高)，与标准曲线比较确定进样中低聚糖各组分的质量，大豆低聚糖色谱示意图见图13-1。

图13－1 大豆低聚糖色谱示意图

5)结果计算

大豆低聚糖的含量计算:

式中: X——大豆低聚糖的含量，%;

mi——低聚糖组分i的质量，mg;

V——样品溶液体积，μL;

V1——进样体积，μL;

m——样品质量，g;

6)说明及注意事项

①本方法低聚糖各单体的检出限为1.0g/kg。

②用HPLC分离低聚糖，使用较多的是氨基柱。在使用氨基柱分离糖时一些还原糖容易与固定相的氨基发生化学反应，产生希夫碱，因此氨基柱的使用寿命短; 且乙腈要求纯度高，价格昂贵。使用氨基柱的另一个缺点是系统平衡所需时间长，一般在5h以上。