黄酮类化合物含量的测定

1.总黄酮含量的测定

1)原理

溶于乙醇的黄酮类化合物在弱碱性条件下，与显色剂三价铝离子结合生成红色的络合物，可在510nm波长处产生最大吸收。在一定浓度范围内，其吸光度与黄酮类化合物的含量呈正比，与标准曲线比较，可定量测定黄酮类化合物的含量。

2)仪器

①可见分光光度计;

②恒温水浴锅;

③高速组织捣碎机;

④旋转蒸发仪;

⑤盐基交换管等。

3)试剂

①芦丁(rutin)标准溶液。

a.芦丁对照品储备液(1.0g/L): 精确称取经120℃减压真空干燥至恒重的芦丁对照品50mg，置于50m L容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。

b.芦丁对照品使用溶液(0.2g/L): 精确吸取芦丁对照品储备液10m L，置于50m L容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀。

②硝酸铝、氯仿、无水乙醇、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯。

③聚酰胺树脂。

4)操作步骤

(1)样品处理

①固体样品: 称取已经干燥粉碎的样品1～2g，加入70%乙醇溶液50～100m L，在80℃水浴下回流提取2h，至黄酮类化合物基本提取完全。粗提液冷却后，减压抽提，并用少量70%乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。在50℃下减压蒸馏，除去乙醇。倒出滤液，并用30m L热水分3次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液到入分液漏斗中，以75m L氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集下层水溶液并定容至50m L。

称取1～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液1～2m L，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70%乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0m L/min，至流出液基本无色，一般收集10m L即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。

②液体样品: 准确吸取样品3.0m L，定容至50m L后，用75m L氯仿分3次萃取脱脂，后续步骤同上。

(2)标准曲线的绘制

精确吸取芦丁对照品使用溶液0m L，1m L，2m L，3m L，4m L，5m L，6m L，分别置于10m L比色管中，加30%乙醇至总体积为5m L，各加5%亚硝酸钠溶液0.3m L，振摇后放置5min，加入10%硝酸铝溶液0.3m L，摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2m L，用30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，在510nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

(3)样品的测定

精密吸取待测样品液1.0m L，置于50m L容量瓶中，按标准曲线的绘制中进行操作。以上述空白溶液作参比。根据标准曲线，计算出样品中黄酮物质的含量。

5)结果计算

黄酮化合物的总含量为:

式中: X——黄酮类化合物的总含量，mg/g;

c——由标准曲线或回归方程得到的芦丁浓度，mg/L;

V——所测样品的体积，1m L稀释成50m L，稀释倍数为50;

d——稀释倍数，50;

m——样品的质量，g。

6)说明及注意事项

①黄酮类化合物对热、氧、适中酸度相对稳定，但遇光迅速破坏，故在实验操作时应避免强光直射或在半暗室中进行。

②对于以葡萄、山楂等有色水果为原料的样品，可用未加铝盐试剂的样液为空白或采用标准加入法进行测定，以避免样液颜色对测定干扰而引起结果偏高。

2.大豆异黄酮含量的测定(GB/T26625—2011)

1)原理

试样用甲醇-水溶液超声波振荡提取，提取液离心、浓缩、定容、过滤，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。

2)仪器

①高效液相色谱仪: 配紫外检测器;

②分析天平: 感量0.01mg、感量0.01g;

③旋转蒸发仪;

④超声波清洗器: 50W;

⑤离心机: 10000r/min;

⑥粉碎机;

⑦组织捣碎机;

⑧样品筛: 孔径2.0mm。

3)试剂与材料

①乙腈: 色谱纯。

②甲醇、乙酸。

③0.1%乙酸乙腈溶液: 取1m L乙酸，置于1000m L容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。

④大豆甙(daidzin)、染料木甙(genistin)、大豆黄素(daidzein)、染料木素(genistein)、黄豆黄素(glycitin)、黄豆黄素甙元(glycitein): 纯度不低于98%。

⑤标准储备溶液配制。

a.大豆异黄酮标准储备溶液: 分别准确取适量的大豆甙、染料木甙、大豆黄素、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素甙元标准品，分别用60%甲醇配成浓度为1mg/m L的标准储备液。-18℃避光保存，有效期6个。

b.大豆异黄酮混合标准中间溶液: 分别移取上述各组分大豆异黄酮标准储备溶液0.5 m L于同一10m L容量瓶中，用60%甲醇定容至刻度，配制成各组分浓度为50μg/m L的大豆异黄酮混合标准中间溶液，0℃～4℃冷藏避光保存，有效期3个月。

c.大豆异黄酮混合标准工作溶液: 分别吸取50.0μL，100.0μL，200.0μL，300.0μL， 1000.0μL上述大豆异黄酮混合标准中间溶液于10m L容量瓶中，用10%甲醇溶液配成各组分浓度0.25μg/m L，0.50μg/m L，1.00μg/m L，1.50μg/m L，5.00μg/m L系列的大豆异黄酮混合标准工作溶液，0℃～4℃冷藏避光保存，有效期一周。

4)操作步骤

(1)样品的制备及提取

取有代表性的样品约500g，用粉碎机粉碎使其全部通过孔径2.0mm样品筛，混匀。称取5.00g试样于250m L具塞三角瓶中，加90m L90%甲醇溶液，置于超声波清洗器中60℃提取30min，在离心机中10000r/min离心10min，上清液转移至250m L浓缩瓶中，残渣再加入60m L90%甲醇溶液进行提取，上清液也转移至250m L浓缩瓶中，在旋转蒸发仪60℃浓缩至约40m L。浓缩液转入50m L容量瓶，用10%甲醇溶液冲洗浓缩瓶并定容至刻度。取1m L提取液通过0.45μm滤膜，待测。

(2)色谱条件

①色谱柱: RPC18柱(250mm×4.6mm，5μm)或性能相当的色谱柱;

②流动相: 0.1%乙酸溶液和0.1%乙酸乙腈溶液，按表13-1进行梯度洗脱;

③流速: 1.0m L/min;

④柱温: 40℃;

⑤波长: 260nm;

⑥进样量: 20μL。

表13－1 梯度洗脱

(3)测定

分别吸取20μL适当浓度的大豆异黄酮混合标准工作液和样品液进行高效液相色谱测定，分别得到大豆异黄酮各组分的标准工作液峰面积和样液中大豆异黄酮各组分峰面积。

在上述色谱条件下，大豆异黄酮各组分的保留时间约为: 大豆甙8.2min、黄豆黄素8.8 min、染料木甙11.0min、大豆黄素15.3min、黄豆黄素甙元16.3min、染料木素19.4min。标准品色谱图见图13-2。

图13－2 大豆异黄酮标准品色谱图

1—大豆甙; 2—黄豆黄素; 3—染料木甙; 4—大豆黄素; 5—黄豆黄素甙元; 6—染料木素

5)结果计算

大豆异黄酮各组分含量:

式中: Xi——样品中某一大豆异黄酮组分含量，mg/kg;

Ai——样品提取液中某一大豆异黄酮组分的峰面积;

Asi——大豆异黄酮混合标准工作液中某一组分的峰面积;

Csi——大豆异黄酮混合标准溶液中某一组分的浓度，μg/m L;

V——样品提取液最终定容体积，m L;

m——样品质量，g。

大豆异黄酮总含量:

X=∑Xi(13-11)

式中: X——样品中总大豆异黄酮含量，mg/kg。

6)说明及注意事项

①本法适用于大豆、豆奶粉、豆豉等豆制品中大豆异黄酮含量的测定。本法的最低检出限为2.5mg/kg。

②本方法中6种异黄酮已经包括大豆中异黄酮的绝大部分组分，可以认为是大豆异黄酮总含量。

③异黄酮类化合物对热、氧、适中酸度相对稳定，但遇光迅速破坏，故在实验操作时应避免强光直射或在半暗室中进行。