牛磺酸含量的测定

1. 邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)柱后衍生法(GB5413.26—2010第一法)

1)原理

样品用偏磷酸溶液溶解，经超声波振荡提取、离心、微孔滤膜过滤后，通过钠离子色谱柱分离，与邻苯二甲醛(OPA)衍生反应，用荧光检测器进行检测，外标法定量。

2)仪器

①高效液相色谱仪，带有荧光检测器;

②柱后反应器;

③荧光衍生溶剂输液泵;

④超声波振荡器;

⑤p H计: 精度为0.01;

⑥离心机: 转速≥5000r/min;

⑦0.45μm微孔滤膜;

⑧天平: 感量为1mg，0.1mg。

3)试剂

①偏磷酸溶液(10g/L): 称取10.0g偏磷酸，用水溶解并定容至1000m L。

②柠檬酸缓冲液: 称取19.6g柠檬酸三钠，加950m L水溶解，加入1m L苯酚，用硝酸调p H至3.10～3.25，经0.45μm微孔滤膜过滤。

③柱后荧光衍生溶剂(邻苯二甲醛溶液)。

a.硼酸钾溶液(0.5mol/L): 称取30.9g硼酸，26.3g氢氧化钾，用水溶解并定容至1000m L。

b.邻苯二甲醛衍生溶液: 称取0.60g邻苯二甲醛，用10m L甲醇(色谱纯)溶解后，加入0.5m L2-巯基乙醇和0.35g聚氧乙烯月桂酸醚Brij-35，用0.5mol/L的硼酸钾溶液定容至1000m L，经0.45μm微孔滤膜过滤。临用前配制。

④牛磺酸标准溶液。

a.牛磺酸标准储备溶液(1mg/m L): 准确称取0.1000g牛磺酸标准品(纯度≥99%)，用水溶解并定容至100m L。储备液在4℃下可保存7天。

b.牛磺酸标准工作液: 将牛磺酸标准储备液用水稀释制备一系列标准溶液，标准系列浓度为: 0μg/m L，5μg/m L，10μg/m L，15μg/m L，20μg/m L。临用前配制。

4)操作步骤

(1)样品的处理

准确称取固体样品1～5g试样，液体样品5.00～20.00g(试样中含牛磺酸5μg以上)，加30m L偏磷酸溶液溶解，充分摇匀，移入100m L容量瓶中; 放入超声波振荡器中振荡10～15min，取出冷却至室温后，用水定容至刻度; 样液在5000r/min条件下离心10min，取上清液经0.45μm微孔膜过滤，接取中间滤液以备进样。

(2)色谱条件

色谱柱: 钠离子氨基酸分析专用柱(250mm×4.6mm)或同等性能的色谱柱;

流动相: 柠檬酸缓冲液;

流动相流速: 0.30m L/min;

荧光衍生溶剂流速: 0.30m L/min;

柱温: 55℃;

检测波长: 激发波长338nm，发射波长425nm;

进样量: 20μL。

(3)标准曲线绘制

将牛磺酸标准系列工作液依次经衍生后按上述推荐色谱条件上机测定，记录色谱峰面积，色谱图参见图13-4。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

图13－4 邻苯二甲醛(OPA)柱后衍生法液相色谱图

(4)试液测定

将试液按上述推荐色谱条件上机测定，从标准曲线中查得试液相应的浓度。

5)结果计算

式中: X——试样中牛磺酸的含量，mg/100g;

C——试液的进样浓度，μg/m L;

V——试样定容容积，m L;

m——试样质量，g。

6)说明及注意事项

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。本方法中，当取样量为10.00g时，检出限为0.5mg/100g。

2. 丹磺酰氯柱前衍生法(GB5413.26—2010第二法)

1)原理

样品用水溶解，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质。取上清液用丹磺酰氯衍生反应，衍生物经C18反相色谱柱分离，用紫外检测器(波长254nm)或荧光检测器(激发波长330nm，发射波长530nm)检测，外标法定量。

2)仪器

①高效液相色谱仪，带紫外检测器或二极管阵列检测器或者荧光检测器;

②p H计: 精度为0.01;

③涡旋混合器;

④超声波振荡器;

⑤离心机: 转速≥5000r/min;

⑥0.45μm微孔滤膜;

⑦天平: 感量1mg，0.1mg。

3)试剂

①1mol/L盐酸溶液: 吸取9m L盐酸，用水稀释并定容到100m L。

②沉淀剂。

沉淀剂Ⅰ: 称取15.0g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至100m L。该沉淀剂在室温下3个月内稳定。

沉淀剂Ⅱ: 称取30.0g乙酸锌，用水溶解并定容至100m L。该沉淀剂在室温下3个月内保持稳定。

③碳酸钠缓冲液(p H9.580mmol/L): 称取0.424g无水碳酸钠，加40m L水溶解，用1mol/L盐酸调p H值至9.5，用水定容至50m L。该溶液在室温下3个月内稳定。

④丹磺酰氯溶液(1.5mg/m L): 称取0.15g丹磺酰氯(色谱纯)，用乙腈(色谱纯)溶解并定容至100m L。临使用前配制。

⑤盐酸甲胺溶液(20mg/m L): 称取2.0g盐酸甲胺，用水溶解并定容至100m L。该溶液在4℃下3个月内稳定。

⑥乙酸钠缓冲液(p H4.2，10mmol/L): 称取0.820g乙酸钠，加800m L水溶解，用冰乙酸调节p H值至4.2，用水定容至1000m L，经0.45μm微孔滤膜过滤。

⑦牛磺酸标准溶液(纯度≥99%)。

a.牛磺酸标准储备溶液(1mg/m L): 称取0.1000g牛磺酸标准品，用水溶解并定容至100m L。储备液在4℃下可保存7天。

b.牛磺酸标准工作液(紫外检测用): 将牛磺酸标准储备液用水稀释制备一系列标准溶液，标准系列浓度为0μg/m L，5μg/m L，10μg/m L，15μg/m L，20μg/m L。临用前配制。

c.牛磺酸标准工作液(荧光检测用): 将牛磺酸标准储备液用水稀释制备一系列标准溶液，标准系列浓度为0μg/m L，0.5μg/m L，0.10μg/m L，0.15μg/m L，0.20μg/m L。临用前配制。

4)操作步骤

(1)试样的处理

①试液提取: 称取固体样品1.00～5.00g，液体样品5.00～30.00g试样(若用紫外检测器，试样中含牛磺酸宜在1μg以上，若用荧光检测器，试样中含牛磺酸宜在50μg以上)于100m L容量瓶中，加入80m L50℃～60℃温水溶解，充分混匀，置超声波振荡器上振荡10min，冷却到室温。加入1.0m L沉淀剂Ⅰ，涡旋混合，加入1.0m L沉淀剂Ⅱ，涡旋混合，用水定容至刻度，充分混匀，试液于5000r/min下离心10min，取上清液备用。上清液在4℃暗处保存放置24h稳定。

②试液衍生化: 吸取1.00m L上述上清液到10m L具塞玻璃试管中，加入1.00m L碳酸钠缓冲液，1.00m L丹磺酰氯溶液，充分混合，室温避光衍生反应2h(1h后需摇晃1次)，加入0.10m L盐酸甲胺溶液涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液备用。衍生物在4℃可避光保存48h。

另取1.00m L标准工作液，与试液同步进行衍生。

(2)参考色谱条件

色谱柱: C18反相色谱柱(内径5μm，250mm×4.6mm)或同等性能色谱柱;

流动相: 10mmol/L乙酸钠缓冲液-乙腈(70+30);

流速: 1.00m L/min;

柱温: 室温;

检测波长: 紫外检测器或二极管阵列检测器: 254nm;

或荧光检测器: 激发波长330nm; 发射波长530nm;

进样量: 20μL。

(3)标准曲线绘制

将牛磺酸标准系列工作液(紫外检测用)或牛磺酸标准系列工作液(荧光检测用)的衍生物依次按上述推荐色谱条件上机测定，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(4)试液测定

将试液衍生物按上述推荐色谱条件上机测定，从标准曲线中查得试液相应的浓度。

5)结果计算

式中: X——试样中牛磺酸的含量，mg/100g;

c——试液的进样浓度，μg/m L;

V——试样定容容积，m L;

m——试样质量，g。

6)说明及注意事项

本方法中紫外检测法检出限为5mg/100g，荧光检测法检出限为0.1mg/100g。

3. 薄层色谱法(GB/T5009.169—2003第二法)

1)原理

试样中牛磺酸，经离子交换柱提纯后，以薄层色谱法定性、定量。

2)仪器

①层析柱: 1.4～30cm;

图13－5 单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图(紫外检测)

图13－6 单磺酰氯柱前衍生法液相色谱图(荧光检测)

②蒸发皿;

③薄层板: 5～20cm;

④微量进样器: 10μL;

⑤展开槽;

⑥水浴锅;

⑦玻璃喷雾器。

3)试剂

①2%盐酸溶液: 准确吸取10.0m L盐酸，加水稀释至500m L;

②40g/L氢氧化钠溶液: 称取4g氢氧化钠，加水溶解至100m L;

③乙醇: 分析纯;

④展开剂:

a.正丙醇+冰醋酸+无水乙醇(5.2+2.2+0.8)。

b.正丁醇+水+无水乙醇(4+1+1)。

⑤强碱性苯乙烯阴离子交换树脂: 717型，用乙醇浸泡过夜，再用水漂洗至水无色;

⑥强碱性苯乙烯阳离子交换树脂: 732型，用乙醇浸泡过夜，再用水漂洗至水无色;

⑦3g/L羟甲基纤维素钠溶液: 称取0.3g羟甲基纤维素钠溶液，加100m L水，加热溶解，放置过夜后，过滤，取滤液备用;

⑧硅胶G: 200目，薄层色谱用;

⑨显色剂: 称取0.5g茚三酮，用50m L乙醇溶解，混匀;

⑩牛磺酸标准溶解: 精密称取0.0200g牛磺酸标准品，用水溶解后移入100m L容量瓶中，并且用水稀释至刻度，即得0.2mg/m L的牛磺酸标准液。

4)操作步骤

(1)离子交换柱的制备

阴离子交换柱: 取已用水漂洗过的717强碱性阴离子树脂，填装1.5～10cm的交换柱，填装时不要混入气泡，先用30m L水洗(流出液为中性)，然后用10m L40g/L氢氧化钠溶液通过柱，将交换柱处理为强碱性，备用。

(2)试样处理

①饮料: 吸取5.0m L均匀试样通过阴离子交换树脂，调流速30滴/min，待液面降至树脂顶端时，先加入25m L水洗脱，再加入25m L2%盐酸溶液洗，弃去以上两次洗脱液，最后用25m L2%盐酸溶液洗脱牛磺酸，用旋转蒸发仪蒸干洗脱液(温度50℃)，准确加入5.0m L水，溶解残渣，溶液过滤于试管中，洗液备作薄层分析用。

②谷类食品: 称取2.0g均匀试样于具塞量筒中，分别用25m L、10m L、10m L水提取三次，每次提取静置15min，用吸管将上清液转入二元离子交换柱，流速调为30滴/min，待流至树脂顶端时，加50m L水淋洗柱子，接受全部上清液和水的洗液，并将其转入阴离子交换柱，流速调为30滴/min，待液面降至树脂顶端时，先加入25m L水洗脱，再加入25m L2%盐酸溶液洗，弃去以上两次洗脱液，最后用25m L2%盐酸溶液洗脱牛磺酸，用旋转蒸发仪蒸干洗脱液(温度50℃)，准确加入2.0m L水溶解残渣，过滤后的滤液进行薄层分析，用过的两支交换柱弃去。

③奶粉: 称取2.0g均匀试样于烧杯中，加25m L水，加热2min，搅匀(勿使其沸腾)，冷却后，转入二元柱，用5m L水洗烧杯，洗液也转入二元柱，流速调为30滴/min，待流至树脂顶端时，加50m L水淋洗柱子，接受洗脱液，并将其转入阴离子交换柱，以下操作按“谷类食品”的操作中“并将其转入阴离子交换柱，流速调为30滴/min……”进行。

(3)测定

①薄层板的制备: 称取15g硅胶G，加47m L3g/L羟甲基纤维素钠溶液(若太稠，再加适量)，研匀，铺成0.25mm厚的5～20cm的薄层板，于105℃±5℃活化1h，取出，置干燥器中备用。

②点样: 在薄层板下端2cm处，用微量注射器点2μL试样溶液，同时点1.0μL，2.0 μL，3.0μL牛磺酸标准溶液三个点，各点间距离1cm。

③展开与显色: 将点好的薄层板放入盛有展开剂(a或b)的展开槽中，展开槽预先用展开剂饱和，展开至12cm(奶粉需18cm)，取出薄层板，晾干，喷显色剂，于80℃烘箱中烘5 min，斑点呈粉色至紫红色，根据斑点大小及颜色深浅进行定量。

5)结果计算

式中: X——试样中牛磺酸的含量，g/kg(或g/L);

A——试样斑点相当于牛磺酸的量，μg;

V1——水浴挥干后加入水的体积，m L;

V2——点样体积，μL;

m——试样质量或体积，g或m L。