磷脂含量的测定

1.钼蓝比色法(GB/T5537—2008)

1)原理

植物油中的磷脂经灼烧成为五氧化二磷，被热盐酸变成磷酸，遇钼酸钠生成磷钼酸钠，用硫酸联氨还原成钼蓝，用分光光度计在波长650nm测定钼蓝的吸光度，与标准曲线比较，计算其含量。

2)仪器

①分光光度计: 具1cm比色皿;

②分析天平: 分度值0.0001g;

③马福炉: 可控制温度，主要使用温度在550℃～600℃;

④封闭电炉: 可调温;

⑤沸水浴;

⑥瓷坩埚或石英坩埚: 50m L、100m L能承受的最低温度600℃。

3)试剂

①1.19g/m L盐酸;

②1.84g/m L浓硫酸;

③磷酸二氢钾: 使用前在101℃下干燥2h。

④2.5%钼酸钠稀硫酸溶液: 量取140m L浓硫酸，注入到300m L水中。冷却至室温，加入12.5g钼酸钠，溶解后用水定容至500m L，充分摇匀，静置24h备用;

⑤0.015%硫酸联氨溶液: 将0.15g硫酸联氨溶解在1L水中;

⑥50%氢氧化钾溶液: 将50g氢氧化钾溶解在50m L水中;

⑦1 1盐酸溶液: 将盐酸溶解在等体积的水中;

⑧磷酸盐标准储备液: 称取干燥的磷酸二氢钾0.4387g，用水溶解并稀释定容至1000 m L，此溶液含磷0.1mg/m L;

⑨绘制标准曲线用磷酸盐标准溶液: 用移液管吸取标准储各液10m L至100m L容量瓶中，加水稀释并定容，此溶液含磷0.01mg/m L。

4)操作步骤

(1)绘制标准曲线

取六支比色管，编成0，1，2，4，6，8六个号码。按号码顺序分别注入磷酸盐标准溶液0 m L，1m L，2m L，4m L，6m L，8m L，再按顺序分别加水10m L，9m L，8m L，6m L，4m L，2 m L。接着向六支比色管中分别加入0.015%硫酸联氨溶液8m L，2.5%钼酸钠溶液2m L，加塞，振摇3～4次，去塞，将比色管放入沸水浴中加热10min，取出，冷却至室温。用水稀释至刻度，充分摇匀，静置10min。移取该溶液至干燥、洁净的比色皿中，用分光光度计在650 nm处，用空白试剂调整零点，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，含磷量(0.01mg，0.02 mg，0.04mg，0.06mg，0.08mg)为横坐标绘制标准曲线。

(2)制备试液

根据试样的磷脂含量，用坩埚称取制好的试样，成品油试样称量10g，原油及脱胶油称量3.0～3.2g(精确至0.001g)。加氧化锌0.5g，先在电炉上缓慢加热至样品变稠，逐渐加热至全部炭化，将坩埚送至550℃～600℃的马福炉中灼烧至完全灰化(白色)，时间约2h。取出坩埚冷却至室温，用10m L1 1的盐酸溶液溶解灰分并加热至微沸，5min后停止加热，待溶解液温度降至室温，将溶解液过滤注入100m L容量瓶中，每次用大约5m L热水冲洗坩埚和滤纸，3～4次，待滤液冷却到室温后，用50%氢氧化钾溶液中和至出现混浊，缓慢滴加1 1盐酸溶液使氧化锌沉淀全部溶解，再加2滴。最后用水稀释定容至刻度，摇匀。制备被测液的同时制备一份样品空白。

(3)比色

用移液管吸取被测试液10m L，注入50m L比色管中。加入0.015%硫酸联氨溶液8m L， 2.5%钼酸钠溶液2m L。加塞，振摇3～4次，去塞，将比色管放入沸水浴中加热10min，取出，冷却至室温。用水稀释至刻度，充分摇匀，静置10min。移取该溶液至干燥、洁净的比色皿中，用分光光度计在650nm下，用试样空白调整零点，测定其吸光度。

5)结果计算

式中: X——试样中磷脂的含量，mg/g;

P——从标准曲线查得的被测液的含磷量，mg;

m——试样质量，g;

V1——样品灰化后稀释的体积，m L;

V2——比色时所取得被测液的体积，m L;

26.31——每毫升磷相当于磷脂的毫克数。

2.重量法

1)原理

植物油中的磷脂吸水膨胀，密度增大，使其由絮状悬浮物转变为沉淀物。将试样水化后，用丙酮反复洗涤过滤，由于磷脂不溶于丙酮，油溶于丙酮，从而可使得磷脂与油分离。称量磷脂的质量，计算其含量。该方法所得到的沉淀过滤物不完全是磷脂，还有其他不溶于丙酮的类脂物质。

2)仪器

①分析天平: 分度值0.0001g;

②电烘箱: 可控制在103℃±2℃。

3)试剂

丙酮: 分析纯。

4)操作步骤

取均匀的样品约100m L置于锥形瓶中，加热至90℃左右时进行过滤。用烧杯称取试样25g(m0)，加热至80℃，加水2.0～2.5m L，充分搅拌使之水化，在室温下静置过夜，或进行离心沉淀。倾出上层清液，用已知恒重的滤纸(m1)(或抽滤)进行过滤，待滤液全部滤出后，用冷的丙酮把杯内残留的沉淀冲洗入滤纸中，继续用丙酮洗涤滤纸和沉淀，洗至无油迹为止。待滤纸和沉淀上的丙酮挥尽后，送入105℃烘箱中烘至恒重并准确称量(m2)。

5)结果计算

式中: X——磷脂含量，mg/g;

m2——沉淀物和滤纸的质量，g;

m1——滤纸质量，g;

m0——试样质量，g。

3. 高效液相色谱法植测定物油脂中磷脂组分(NY/T1798—2009)

1)原理

油脂试样用氯仿溶解提取，用氨基固相萃取柱纯化，高效液相色谱分离，外标法定量。

2)仪器

①分析天平: 感量0.1mg;

②具塞离心管: 100m L;

③漩涡混合器;

④真空旋转蒸发仪;

⑤氨基固相萃取柱: 6m L，1000mg或性能相当者;

⑥离心机;

⑦液相色谱仪: 带有紫外检测器; 色谱柱: 正相硅胶柱Si60-5(5μm，250mm×4.6 mm)或性能相当者。

3)试剂

①甲醇、正己烷、异丙醇均为色谱纯，其他为分析纯;

②乙酸-乙醚混合溶液(2+144);

③氯仿-异丙醇混合溶液(2+1);

④正己烷-异丙醇混合溶液(1+1);

⑤0.025mol/L乙酸铵水溶液: 称取1.925g乙酸铵，用一级水溶解并定容到1000m L;

⑥磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇标准品，纯度＞95%;

⑦10mg/m L磷脂标准储备溶液: 准确称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)各100mg，用正己烷-异丙醇混合溶液溶解并定量至10m L，制备成10mg/m L的标准储备溶液。改标准储备溶液在4℃下，可以稳定储藏3个月。

4)操作步骤

(1)样品提取净化

准确称取油脂试样4.000g，置于100m L具塞试管中，加入50.0m L氯仿，漩涡混合。先用1.0m L氯仿活化氨基固相萃取柱，将10.0m L油脂氯仿溶液移入氨基硅胶固相萃取柱中，然后依次用2.0m L氯仿-异丙醇混合溶液和3.0m L的乙酸-乙醚混合溶液洗脱小柱，弃去洗脱液，然后用3.0m L甲醇洗脱出磷脂，再重复四次，并收集到的15.0m L甲醇溶液几种，氮气吹干，加入10.0m L正己烷-异丙醇混合溶液溶解，在4000r/min下离心5min，取上清液用于液相色谱分析。

(2)色谱分析

取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)标准储备溶液用正己烷-异丙醇混合溶液稀释至0.05mg/m L，1.00mg/m L，2.00mg/m L，3.00mg/m L和4.00mg/m L标准工作溶液，连同样品依次进样，进行液相色谱检测，以峰面积—浓度建立工作曲线。

色谱参考条件:

色谱柱: 正相硅胶柱Si60-5(5μm，250mm×4.6mm)，或性能相当者;

流动相: 正己烷+异丙醇+乙酸铵水溶液=(8+8+1);

检测波长: 220～240nm之间最大吸收波长;

流速: 1m L/min;

柱温: 30℃;

进样量: 10μL。

图13－7 磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰胆碱(PC)标准品的色谱图

5)结果计算

试样中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的含量X以每克试样中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)的毫克数(mg/g)表示:

式中: P——从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，mg/m L;

V——样品溶液定容体积，m L。

m——样品溶液所代表试样的质量，g;

测定结果取其两次测定的算术平均值，计算结果保留到小数点后两位。

6)说明及注意事项

①本方法适用于大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇的测定。

②本方法磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇方法检出限分别为: 0.12mg/g，0.38 mg/g，0.75mg/g; 线性范围分别为0.08～8.00mg/m L，0.15～15.00mg/m L，0.30～30.00 mg/m L。