皂苷含量的测定

1. 高效液相色谱法测定大豆皂苷含量(GB/T22464—2008第一法)

1)原理

试样用80%乙醇溶解后，经0.45μm滤膜过滤，采用反相键合相色谱测定，根据色谱峰保留时间进行定性，根据峰面积或峰高定量，计算大豆皂苷各单体的含量之和为大豆皂苷含量。各单体的检出限为0.1g/kg。

2)仪器

高效液相色谱仪: 带紫外检测器。

3)试剂

①甲醇、乙醇: 优级醇;

②80%乙醇溶液: 量取800m L无水乙醇加水稀释至1000m L;

③大豆皂苷标准溶液: 称取A类、B类、E类及DDMP类大豆皂苷单体标准品(含量≥98%)各10.0mg置于100m L容量瓶中，用80%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，每毫升溶液分别含每种大豆皂苷单体标准品0.10mg。

4)操作步骤

(1)试样制备

称取试样约0.1g，精确至0.001g，加80%乙醇溶液溶解并稀释定容至100m L，混匀，通过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液备作高效液相色谱(HPLC)分析用。

(2)色谱参考条件

色谱柱: Nova-pak C18柱3.9mm×300mm，或相同性质的填充柱;

流动相: 甲醇-水溶液(80+20);

流速: 1.0m L/min;

检测器: 紫外检测器，205nm波长，0.2AUFS;

色谱柱温度: 30℃;

进样量: 10μL。

图13－12 A类、B类、E类和DDMP皂苷的结构

(3)测定

在相同的色谱分析条件下，分别取10μL大豆皂苷溶液和试样溶液注入高效液相色谱分析，根据保留时间定性，外标峰面积定量。

5)结果计算

式中: X——产品中大豆皂苷的含量，%;

V——样品稀释总体积，μL;

Ai——进样体积中大豆皂苷单体组分i的质量，mg;

V1——进样体积，μL;

m——样品质量，g。

2.分光光度法测定大豆皂苷(GB/T22464—2008第二法)

1)原理

样品用50%甲醇水溶液溶解后，在酸性条件下水解，以乙酸乙酯萃取出苷元，与香草醛、高氯酸反应显色，在560nm波长下测定吸光度，与标准曲线比较定量。

2)仪器

分光光度计等。

3)试剂

①高氯酸;

②95%乙醇;

③乙酸乙酯;

④50%甲醇溶液: 量取100m L甲醇加入100m L水中，摇匀;

⑤2mol/LHCl溶液: 量取16.5m LHCl加水稀释至100m L;

⑥5%香草醛冰乙酸溶液: 称取5.00g香草醛溶于100m L冰乙酸中，摇匀;

⑦大豆皂苷标准溶液: 称取大豆皂苷单体标准品或混合标准品(含量≥98%)10.0mg用少量50%甲醇溶液溶解后，加入2mol/LHCl60m L100℃水解5h，用70m L乙酸乙酯分数次萃取，提取液用旋转蒸发仪蒸干后，用95%乙醇溶解并转移至100m L容量瓶中，以95%乙醇定容至刻度，摇匀。每毫升溶液含大豆皂苷0.10mg。

4)操作步骤

(1)试样制备

称取试样约0.1g，精确至0.001g，溶于50m L50%甲醇溶液中，用50%的甲醇溶液定容于100m L，取10m L加入2mol/LHCl溶液60m L，100℃水解5h，用70m L乙酸乙酯分数次萃取，提取液用旋转蒸发仪蒸干后，用95%乙醇溶解并转移至容量瓶中，以95%乙醇定容至100m L作为待测样液。

(2)标准曲线的绘制

取大豆皂苷标准溶液0m L，0.1m L，0.2m L，0.3m L，0.4m L，0.5m L，0.6m L，0.7m L (相当于大豆皂苷0mg，0.01mg，0.02mg，0.03mg，0.04mg，0.05mg，0.06mg，0.07mg)于10m L具塞试管中，水浴挥干，加5%的香草醛冰乙酸溶液0.2m L，加入高氯酸0.8m L，摇匀，60℃水浴加热15min，取出后立即用流水冷却，加入4m L冰乙酸稀释摇匀后，在波长560nm处以0管调零，测定吸光度，每个浓度平行测定两次，计算平均吸光度值，以吸光度值为横坐标，大豆皂苷质量(mg)为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)测定

吸取待测试样0.4m L于10m L具塞试管中，水浴挥干，加5%的香草醛冰乙酸溶液0.2 m L，加入高氯酸0.8m L，摇匀，60℃水浴加热15min，取出后立即用流水冷却，加入4m L冰乙酸稀释摇匀后，在波长560nm处以0管调零，测定吸光度，与标准曲线比较定量。

5)结果计算

式中: X——产品中大豆皂苷的含量，%;

A——样液中大豆皂苷的质量，mg;

V——样品稀释总体积，m L;

V1——水解时取样液体积，m L;

V2——水解时液定容体积，m L;

V3——测定用水解液定容体积，m L;

m——样品质量，g。

3.人参皂苷(ginsenoside)的测定

1)原理

试样经乙醚脱脂后，用甲醇索氏提取，提取后的样液用SPEC18柱净化，利用高效液相色谱仪对试样中的9种人参皂苷进行分离和测定，外标法定量。

2)仪器

①高效液相色谱仪: 配有紫外检测器;

②电子天平: 感量0.001g，0.0001g;

③旋转蒸发仪;

④索氏提取器;

⑤控温水浴;

⑥循环水用真空泵;

⑦粉碎机;

⑧样品筛: 孔径0.25mm;

⑨SPEC18小柱:1000mg填料，6m L;

⑩微量进样器: 5～50μL。

3)试剂

①70%乙醇溶液: 取700m L无水乙醇，用去离子水稀释至1000m L;

②甲醇: 色谱纯;

③乙醚: 分析纯;

④人参皂苷标准品: Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rf(含量98%);

⑤标准混合溶液: 逐一准确称取0.183g Re，0.163g Rg1，0.102g Rf，0.102g Rg2， 0.255g Rb1，0.306g Rc，0.367g Rb2，0.408g Rb3，0.214g Rd(精确至0.001g)人参皂苷标准品，置于100m L容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为1.8g/L，1.6g/L，1.0g/L， 1.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.6g/L，4.0g/L和2.1g/L的混合标准溶液，贮存在-18℃以下冰箱中，有效期6个月。

4)操作步骤

(1)样品提取

准确称取人参干样2g(精确至0.001g)，加入100m L乙醚于索氏提取器中，提取1h，弃去乙醚，待残渣中乙醚挥干后，再加入甲醇回流8h。

(2)样品净化

①SPEC18柱的预处理: 先用20m L去离子水淋洗SPEC18柱，然后用20m L的甲醇进行活化，再用20m L去离子水平衡。待水与柱筛板近平时上样。

②提取液的处理: 提取液在60℃水浴条件下，经旋转蒸发仪减压浓缩至近干，氮气吹干，加入4m L去离子水充分摇匀。取2m L注入预先活化好的SPEC18柱中，待液面与柱筛板近平时，倒入10m L去离子水淋洗SPEC18柱，弃去流出液，待淋洗液液面与柱筛板近平时，加入25m L70%乙醇溶液洗脱SPEC18柱，收集洗脱液于50m L刻度试管中，氮气吹至25m L以下时，用甲醇定容至25m L，混匀后，用0.2μm滤膜过滤，待测。

(3)色谱参考条件

色谱柱: C18(4.6mm×300mm×0.5μm)或相当者;

流动相: 甲醇+水; 梯度洗脱程度见表13-5;

柱温: 47℃;

流速: 0.5m L/min～0.8m L/min;

检测波长: 202nm;

进样量: 10μL。

表13－5 梯度洗脱程序

(4)标准曲线的绘制

用混合皂苷标准工作液按着梯度洗脱程序进行分析。准确吸取0m L，2m L，4m L，6 m L，8m L，10m L混合皂苷标准溶液，分别置于10m L容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，准确吸取10μL各容量瓶中的标准溶液，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。以各皂苷进样的质量浓度对峰面积绘制标准曲线。

(5)样品测定

准确吸取10μL供试样品溶液注入液相色谱仪，以保留时间定性，以待测液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。

除不称取试样外，采用试样完全相同的测定步骤进行平行操作，做空白实验。

图13－13 9种人参皂苷标准品的液相色谱图

1—Re; 2—Rg1; 3—Rf; 4—Rg2;

5—Rb1; 6—Re; 7—Rb2; 8—Rb3; 9—R4

5)结果计算

式中: X——试样中人参皂苷的含量，%;

m1——试样中某种人参皂苷的质量，g;

m2——试样的质量，g;

V1——试样的进样体积，m L;

V2——试样的定容体积，m L。

6)说明及注意事项

该方法的检出限分别为Re: 0.05 g/kg，Rg1: 0.05 g/kg，Rf: 0.05 g/kg，Rg2:0.05g/kg，Rb1: 0.07g/kg，Rc: 0.10g/kg，Rb2: 0.10 g/kg，Rb3: 0.06 g/kg，Rd: 0.06 g/kg。