多不饱和脂肪酸含量的测定

1.气相色谱法

1)原理

多不饱和脂肪酸(PUFA)是指含量两个或两个以上双键、碳原子数在16～22的直链脂肪酸，包括γ-亚麻酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)。采用盐酸水解法提取其油脂，并用CHCl3-KOH-CH3OH一步提取、甲酯化方法，运用毛细管气相色谱分析，以外标法定量测定甲酯化样品中多不饱和脂肪酸的含量。

2)仪器

①气相色谱仪: 附氢火焰离子化检测器;

②超级恒温水浴: 精度( ±0.1℃)。

3)试剂

①氯仿;

②石油醚-苯(1+1);

③GLA，EPA和DHA的甲酯标准储备液: 采用Sigma公司标准品(GLA，cis-5，8，11， 14，17 - Pentaenoic Acid Methyl Ester，Approx. 99%，cis - 4，7，10，13，16，19 -Docosahxaenoic Acid Methyl Ester，Approx.98%)。准确称取0.100 g GLA，0.050 g EPA和0.100g DHA，用正己烷溶解并定容于10m L容量瓶，此标准储备液GLA浓度为10.0mg/m L， EPA浓度为5.0mg/m L，DHA浓度为10.0mg/m L;

④GLA，EPA和DHA的甲酯标准使用液: 将标准储备液用正己烷稀释成EPA浓度为1.00mg/m L，2.00mg/m L，3.00mg/m L，4.00mg/m L，5.00mg/m L，GLA和DHA浓度为2.00mg/m L，4.00mg/m L，6.00mg/m L，8.00mg/m L，10.00mg/m L。

4)操作步骤

(1)样品处理

①直接酯化法: 将含有多不饱和脂肪酸的样品进行冷冻干燥，称取1g样品于具塞试管中，加入4m LCHCl3和2m L0.5mol/LKOH-CH3OH，剧烈振荡2min; 并于50℃水浴保持10min(充氮气保护)，剧烈振荡2min; 加入3.6m L双蒸水，再剧烈振荡1min。过滤，静置分层，取下层CHCl3相用于色谱分析。

②酸水解法: 取一定量样品，以0.4mol/L盐酸水解后，置于25m L具塞试管中，加入2m L石油醚-苯混合试剂，轻摇使溶解后加入2m L0.5mol/LKOH-CH3OH，于室温酯化10～15min后水洗，静置分层后取上层有机相用于色谱分析。

(2)色谱参考条件

色谱柱: HP-IN-NOWAX交联聚乙二醇毛细管柱，0.25mm×30m，0.25μm;

升温程序: 150℃→200℃(Δ=15℃/min，升至200℃后(保持15min)→240℃(Δ=2℃/min，升至240℃后持续2min);

气体流速: 氢气流速30m L/min，空气流速150m L/min，氮气流速30m L/min;

温度: 进样口260℃，检测器260℃;

进样量: 1μL。

(3)标准曲线的绘制

用微量进样器准确取1μL标准系列各浓度标准使用液注入气相色谱仪，以测得的不同浓度的GLA，EPA和DHA的峰高为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(4)样品测定

准确吸取1μL样品溶液进样，测得的峰高与标准曲线比较定量。

5)结果计算

式中: X——样品中EPA，DHA或GLA的含量，μg/g;

V——样品溶液的最终定容体积，m L;

c——测定液中EPA，DHA或GLA的浓度，μg/m L;

m——样品质量，g。

6)说明及注意事项

①EPA和DHA回收率分别为(96.2±3)%和(95.8±4)%，精密度相对标准差分别为1.86%和2.11%。

②由于多不饱和脂肪酸极易被空气所氧化，一般都要对其充氮气或加入抗氧化剂保护。

③在测定油脂中多不饱和脂肪酸的含量时，需将油脂抽提出来。经典的方法是取干燥研磨的样品于索氏提取器中以非极性有机溶剂抽提。而采用魏氏盐酸水解法来提取其油脂，样品无需干燥，所需时间短，且油脂提取率较高，适合于微生物油脂的提取。

2.分光光度法

1)原理

在室温条件下样品皂化，随后在盐酸作用下生成脂肪酸，具有顺，顺1，4-二烯结构(即n-3，n-6系列的脂肪酸)的脂肪酸被酶促氧化，产生的氧化酸在最大吸收波长(约235nm)下测定吸光度，同时做样品空白试验，计算样品中多不饱和脂肪酸的含量。

2)仪器

①离心机;

②水浴锅;

③紫外分光光度计;

④分析天平。

3)试剂

①0.5mol/LHCl溶液;

②氢氧化钾-乙醇溶液: c(KOH) =0.5mol/L。

③储备液: 称取65 g氢氧化钾(86%氢氧化钾)溶于约80 m L水中，冷却后稀释至100m L; 临用前吸取5m L储备液用体积分数95%的乙醇稀释至100m L。

④1.0mol/Lp H9.0的硼酸钾缓冲液: 称取61.9g硼酸和25.0g氢氧化钾(86%氢氧化钾)加热搅拌溶于约800m L水中，冷却至室温，测定p H，如有必要，可用HCl或KOH溶液调p H为9.0，然后用水稀释至1000m L。

⑤0.2mol/Lp H9.0的硼酸钾缓冲液: 将200m L1.0mol/Lp H9.0的硼酸钾缓冲液用水稀释至1000m L，并冷却。

⑥脂肪氧化酶稀释液。

a.脂肪氧化酶: 酶的活力至少为50000U/mg［一个酶的活力单位(U)定义为实验条件下，每分钟可氧化1.2×10-4μmol亚油酸所需的酶量］。

在冻干状态下，于-18℃或更低的温度保存时，该酶在数年内都是稳定的。

b.储备液: 称取相当于650000U酶活的酶溶于10m L冰冷的0.2mol/L硼酸钾缓冲液中，该储备液在-18℃或更低的温度下可长期保存。

c.工作液: 将2m L储备液和8m L冰冷的0.2mol/L硼酸钾缓冲液混合。

⑦脂肪氧化酶灭活液: 吸取数毫升脂肪氧化酶稀释液至试管中，并保证无液滴粘附在试管壁上。将试管浸入沸水浴中加热至少5min，稀释液的液面应低于沸水浴的液面。

⑧参比油: 如葵花籽油或棉籽油，已知多不饱和脂肪酸含量(用气相色谱法准确测得，并以参比油的质量分数表示)，并假定其全为顺，顺1，4-二烯结构的脂肪酸。

⑨氮气: 纯度不低于99.5%。

4)操作步骤

(1)验证实验

在分析试样时，建议与试样平行分析已确知多不饱和脂肪酸含量的参比油，以核对分析步骤。

(2)试样的皂化

称取50～200mg试样，精确至0.1mg，于100m L容量瓶中。用移液管吸取10m L氢氧化钾-乙醇溶液至试样的容量瓶中，用氮气置换容量瓶中的空气。加塞，放置暗处，皂化至少4h，间歇摇动容量瓶使内容物混匀。

如果样品的熔点高于室温，可将装有样品的容量瓶(加塞)置于50℃的水浴中加热数分钟，以加速皂化。

(3)测试液的制备

①皂化后，用适当的移液管向容量瓶中加入20m L1.0mol/L的硼酸钾缓冲液10m L0.5 mol/L的HCl溶液，加水稀释至刻度。轻轻摇匀，尽量避免产生泡沫。如果沉淀产生，离心分离除去沉淀。

②用移液管吸取容量瓶中溶液1m L(或1m L离心分离的上清液)至另一100m L容量瓶(事先用氮气吹洗)中，如果试样中多不饱和脂肪酸含量少，应吸取2～4m L试样。

③用移液管吸取20m L1.0mol/L的硼酸钾缓冲液至容量瓶中，加水至刻度。加塞混匀，尽量避免产生泡沫。这个步骤中轻微的浑浊不会影响后续的测定。

(4)标准曲线绘制

①标准溶液的制备: 称取相当于含100mg多不饱和脂肪酸的参比油于100m L容量瓶中，精确至0.1mg，按照上述操作(2)及(3)中①的操作进行中试样的皂化处理并稀释至刻度。

用移液管吸取10m L上述溶液至另一只100m L容量瓶中，加入18m L1.0mol/L的硼酸钾缓冲液，用水稀释至刻度。

用吸管吸取上述溶液分别为1m L，2m L，4m L，6m L，8m L，10m L溶液，分别置于6个100m L容量瓶中，均用0.2mol/L的硼酸钾缓冲液稀释至刻度。

②酶促氧化: 分别吸取0.1m L脂肪氧化酶稀释液置于6支试管中，分别添加3m L相应的标准溶液，轻轻振荡使溶液混匀。将试管静置20min ～30min。

③补偿溶液: 以0.1m L脂肪氧化酶灭活液代替脂肪氧化酶稀释液来制备样品补偿溶液。

④绘制标准曲线: 用石英比色皿，在235nm处测定吸光度，以补偿溶液调节零点。以吸光度与已知组成的参比油计算所得不饱和脂肪酸的质量作图。

(5)测定

①酶促氧化: 吸取1m L脂肪氧化酶稀释液至试管中，再吸取3m L测试液加到试管中，轻轻振荡使溶液混匀。将试管静置20～30min。

②分光光度计测定: 用石英比色皿，在235nm处测定样品吸光度，以补偿溶液调节零点。根据标准曲线计算脂肪酸的含量。

5)结果计算

式中: X——样品中多不饱和脂肪酸的含量，g/100g;

m0——样品的质量，mg;

m1——根据标准曲线计算的多不饱和脂肪酸的质量，mg;

V——从容量瓶中吸取液体的体积，m L。

6)说明及注意事项

①本法适用于n-3，n-6系列多不饱和脂肪酸含量的测定，不适用于n-8，n-9系列多不饱和脂肪酸及含有支链脂肪酸含量的测定。

②脂肪氧化酶的活力如果偏低会导致结果偏低，而过高活力的酶制剂不会比活力在50000U/g～100000U/g酶制剂得到更好的结果。

③当所取试样中多不饱和脂肪酸的含量在10～80mg时，所测吸光度在0.07～0.5之间。

④在测试液制备时，皂化后，得到皂的稀释液。泡沫中皂的浓度要高于液体本体中皂的浓度，当溶液从一个容量瓶转移到另一个容量瓶时，如果有泡沫粘附在移液管上，可能导致转移了未知过量的脂肪酸。

⑤酶促氧化过程可在具塞分光光度计比色杯中进行，以免在测量吸光度前再将溶液转移到比色杯中。

⑥酶促氧化过程中试管中样品的处理很重要。将内容物初次混合后，不要再进一步混合，进一步混合会导致标准溶液、样品补偿溶液及测试溶液的吸光度增加。此外，如果比色杯中溶液一旦倒掉，再装入其他溶液，则不能核对该测量值是否正确。溶液处理过程中造成吸光度增加的原因尚无法解释，因此要确保分析步骤一致。

⑦以补偿溶液调节零点时，可以补偿由于样品中原有的共轭二烯酸产生的吸光度。样品溶液的补偿吸光度应以水为参比进行核对，如果与测试液相比，此值太高，将使精密度降低。