培养细胞增殖特性的检测

培养中的细胞生长、增殖和死亡是一个动态过程。这一过程的时间和数量表达可充分反映出培养细胞群体增殖动力学过程。常用的分析方法有计数法测生长曲线、四甲基偶氮唑盐微量酶反应法（MTT法）及3　HTdR渗入法。

一、计数法测定培养细胞的生长曲线

能在体外连续培养的细胞都有自身稳定的生长、增殖特性，生长曲线就是观察细胞生长、增殖最常用的方法。通过细胞计数的方法来测定细胞绝对增长数值，用以了解细胞生长增殖规律。此法常用于细胞建系和药物对肿瘤细胞的杀伤作用研究。

【实验用品】

1．器材　CO2培养箱、超净工作台、显微镜、血细胞计数板、培养瓶或各种培养板、各种吸管。

2．试剂　1640培养液、小牛血清、0．25%胰蛋白酶溶液。

3．材料　培养的贴壁细胞或悬浮生长细胞。

【操作步骤】

1．细胞悬液制备　取生长良好的细胞采用一般传代方法消化贴细胞，或离心悬浮生长细胞，制备成细胞悬液。

2．接种细胞　在各培养瓶或培养板内准确接种相同数量的细胞，常用的接种浓度为1×105～1×106细胞／ml。

3．计数　每天取三瓶或3个孔计数，计数时如图3－7所示，将一小滴细胞悬液从盖玻片交界部位滴入细胞计数池中；沉降1min，低倍镜下计数血细胞计数板四大中格中的结构完整的细胞，小细胞团计数为1，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右；按下式计算出每毫升悬液中的细胞数：（四大格中细胞数／4）×10　000＝细胞数／毫升。测出每瓶或每孔的细胞总数，求出每组平均值，持续计数7d（也可根据需要而定）。

图3－7　细胞计数方法

4．绘制生长曲线　将每天计数所得的细胞浓度标在对数坐标纸上，然后将各点连成曲线，即生长曲线。

【结果分析】　标准的生长曲线近似S形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏期，其后进入对数生长期。达到平台期后生长稳定，最后进入衰老期。在生长曲线上细胞数量增加1倍所需要的时间称为细胞倍增时间。细胞传代和各种实验多应选择在此区细胞进行。

【注意事项】　细胞接种时，每瓶或每孔接种的细胞总数和加入的培养液要求一致。细胞接种的数量不能过多也不能太少。一般接种数量以7～10d能长满而不发生生长抑制为度。计数时易出现误差（20%～30%），为提高准确性，每瓶或每孔应计数2～3次。

二、培养细胞活率测定

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的，必须进行细胞活率测定。其原理是当细胞死亡时，某些染料能透过变性的细胞膜，与解体的细胞核DNA结合，使其着色，因而能鉴定死细胞与活细胞。常用的染料有苔盼蓝（trypan　blue，又名曲利本蓝）。

【操作步骤】　细胞活率测定时用0．4%苔盼蓝染液（0．4g苔盼蓝加热溶于1　00ml pH　7．4BBS液中）。细胞悬液和染液按1∶1体积比混合后加盖玻片，1min后计数100～200个细胞。活细胞呈圆形透明，死亡细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活率。

三、MTT法测细胞增殖

MTT法的主要原理是活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成蓝色产物甲臜（formazan），并沉淀在细胞中，沉淀的量与活细胞数和功能状态呈正相关。DMSO能溶解沉淀，溶液颜色深浅与所含的甲臜量成正比，再用酶标仪测定OD值。MTT法简单、快速，广泛用于新药筛选、细胞毒性试验等。该法的缺陷是灵敏性较差、重复性不佳、仅适用于贴壁生长的细胞，但已有许多学者作出多方面的改进。

【实验用品】

1．器材　CO2培养箱、超净工作台、酶联检测仪、微孔板振荡器、96孔培养板、各种吸管。

2．试剂　1640培养液、小牛血清、DMSO、MTT溶液（MTT溶于pH　7．4的0．01mol／L　PBS液中，磁力搅拌30min，过滤除菌，配制成2mg／ml的MTT液，4℃保存）。

3．材料　培养的贴壁生长细胞。

【操作步骤】

1．单细胞悬液接种于96孔培养板，103～104／孔，每孔培养液总量200μl，37℃、5%CO2培养箱中培养一段时间后（根据实验目的决定培养时间）加入MTT液（20μl／孔），继续培养4h。

2．吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150μl／孔），室温下，将平板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解。

3．酶标仪检测各孔OD值（570nm）。记录结果，统计分析。

【注意事项】

1．细胞接种浓度预选　96孔培养板的每孔当细胞贴壁长满时约为105个，但不同细胞贴壁后差异很大。因此进行MTT实验时，应先对某种细胞测试贴壁率、倍增时间以及在不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间。这样可以保证终止培养时不致细胞过满，使MTT结晶形成量与细胞数呈良好的线性关系。

2．设空白对照孔　实验中设不加细胞只加培养液的孔为空白对照孔，其他操作与实验组相同。最后比色时，以空白对照孔调零。

四、3H－ TdR渗入法

当细胞进入对数生长期时，在培养液中加入放射性核素氚标记的脱氧胸腺嘧啶核苷（3　H－thymidine，3　H－TdR）作为DNA合成前体引入细胞群，处在DNA合成期（S期）的细胞在进入M期时被3　H－TdR渗入，DNA被标记。根据渗入细胞内放射性核素的量，可推测细胞增殖的活动状态和程度。3　H放出β射线，能量极低（0．018eV），用液体闪烁计数仪测出其脉冲数，以每分钟脉冲数（cmp）为计算单位。cpm值代表细胞增殖浓度，增殖越多，3　H－TdR渗入越多，cpm值也越大。

【实验用品】

1．器材　CO2培养箱、超净工作台、放射性核素液闪计数仪、96孔培养板、各种吸管。

2．试剂　1640培养液、小牛血清、pH 7．2PBS液（NaCl　8．0g，KCl　0．2g，Na2 HPO41．15g，KH2PO40．2g，蒸馏水100ml）、3　H－TdR，三氯乙酸（TCA）、NaOH。

3．材料　培养的贴壁细胞。

【操作步骤】

1．种板，按常规细胞传代方法制备细胞悬液后，每孔接种约1×104细胞（根据不同细胞及实验需要来确定接种细胞数），37℃、5%CO2培养箱培养一定时间后加处理因素。

2．处理结束后，加入0．1～0．2mCi／L 3　H－TdR，培养2h。

3．去培养上清，PBS洗两次，加入预冷10%TCA　4℃保持10min，再以TCA漂洗3次，每次5min。

4．每孔中加入预温60℃的2mol／L NaOH　200μl裂解细胞。

5．加闪烁液3ml，在液闪计数仪上测放射强度（cpm值），对实验结果作统计分析。

【注意事项】　每个组设三个复孔，同时还必须设不加刺激因素的对照孔。细胞生长情况的愈好，所测得cpm值愈高。