培养细胞的检测

培养细胞的检测_组织工程学实验技

一、培养细胞DNA的提取

培养的真核细胞在蛋白酶K、SDS、RNA酶的作用下，消化破裂细胞膜与核膜，蛋白质变性并降解成小肽或氨基酸；DNA从核蛋白中游离，与蛋白质分开，同时RNA酶降解污染的RNA。用饱和酚、氯仿抽提使蛋白质与DNA脱离，在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA，最后得到欲提取的DNA。

【实验用品】

1．器材　移液器、低温离心机、冰箱、Tip头、Eppendorf管、紫外分光光度计、水浴箱。

2．试剂

（1）DNA提取液：10mmol／L　pH8．0 Tris－HCl、0．1mol／L　pH8．0EDTA、20μg／ml胰RNA酶、0．5%SDS。

（2）TE缓冲液：10mmol／L　pH8．0Tris－HCl、1mmol／L　pH8．0EDTA。

（3）其他试剂：20mg／ml蛋白酶K、3mol／L　pH5．2醋酸钠（NaAc）、Tris－HCl pH8．0饱和酚、10mmol／L　pH7．4PBS、氯仿∶异戊醇（24∶1）、无水乙醇。

3．材料　体外培养的细胞。

【操作步骤】

1．对于悬浮培养的细胞，以1　500g　4℃离心10min收集细胞，弃培养液。用预冷的PBS液离心洗涤细胞2次。按5×106／ml加入DNA提取液，悬浮细胞，37℃水浴温育1h。

2．对于贴壁生长的细胞，弃培养液，用预冷的PBS液漂洗涤细胞3次，尽量除净瓶内PBS，按5×106／ml加入DNA提取液至瓶内，晃动瓶至液体变黏稠。将其移入离心管内，37℃水浴温育1h。

3．加入蛋白酶K到终浓度为100～ 200μg／ml，上下转运混匀。37℃水浴温育3h或37℃水浴过夜，裂解细胞、消化蛋白。保温过程中，应不时转运离心管，混匀反应液。

4．加入等体积的饱和酚溶液温和地上下转动离心管5～10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5　000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层黏稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提1次。加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），上下倒转混匀，5　000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层黏稠水相，移至另一离心管中。重复1次。

5．加入1／5体积的3mol／L　NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，待乳白色絮状DNA出现后，用牙签或玻璃棒小心挑取DNA，转入另一离心管中，加70%乙醇1ml，5　000g离心5min洗涤DNA，弃上清，去除残余的盐。

6．室温尽量挥发残留的痕量乙醇，但不要让DNA完全干燥。按5×107个细胞DNA提取物加TE液1ml溶解DNA。溶解过程通常需要12～24h。

7．DNA的浓度测定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液做空白对照，在紫外分光光度计读取A260和A280的光密度值。按以下公式计算浓度：DNA浓度（μg／μl）＝A260×50×稀释倍数／1　000。

8．DNA纯度的判定：A260／A280比值应在1．7～2．0之间。

【注意事项】

1．器皿和试剂的无DNA酶化处理：通过高压、干烤等方法去除试剂、器材等的DNA酶。

2．仔细吸取酚抽水相：酚抽提离心后，转移上层水相时，用大口吸管非常缓慢地将上层含DNA相吸入吸管内，勿带动界面。

3．避免DNA大分子剪切：提取过程中每一步的混匀，动作不可剧烈，防止机械剪切对林分子DNA的破坏而不能获得大分子的DNA。75%乙醇洗涤DNA后晾干时，注意不要让DNA完全干燥，否则极难溶解。

二、DNA的凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的首选标准方法。琼脂糖的浓度变化所形成大小不同的分子筛网孔，可分离不同分子量的核酸片段。

【实验用品】

1．器材　电泳仪、移液器、水平式凝胶电泳槽、紫外线检测仪、微波炉、照相机等。

2．试剂　5×TBE：54．0g　Tris、27．5g

硼酸、20ml　0．5mol／L　pH8．0EDTA，用时10倍稀释；溴化乙锭（ethidium　bromide，EB）：用水配制成10mg／ml的储存液，分装，避光4℃保存；6×加样缓冲液：0．25%溴酚蓝、0．25%二甲苯青FF、40%（W／V）蔗糖溶液，4℃保存；电泳级琼脂糖。

【操作步骤】

1．用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好，形成一个胶模，水平放在工作台的位置上。

2．用TBE电泳缓冲液在水浴上或微波炉上将琼脂糖颗粒用最短时间完全溶解，所用的浓度参见表3－3。熔化的琼脂糖溶液冷却到60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0．5μg／ml，充分混匀。

表3－3　凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围（kb）

3．在胶模上放置好梳子后，半温热凝胶倒入胶模中，凝胶的厚度在3～5mm之间。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

4．凝胶凝固后，小心移去梳子和胶带纸，将凝胶往往放入电泳槽。也可同时制作几块凝胶，待其固化后用保鲜纸包住以防水分挥发，4℃保存。

5．加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1～2mm，如加样孔内有水泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。

6．将样品与上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内。

7．盖上电泳槽并通电，60～100V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动。

8．电泳完成后切断电源，取出凝胶，直接在透射紫外灯下观察。

9．用加红色滤色镜的相机，光圈放到最大，曝光15～30s，拍照留底，或在凝胶图像分析仪上观察分析并留底。

【注意事项】

1．电压。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，一般凝胶电泳的电场强度不超过5V／cm，对于大分子真核基因组DNA分子的电泳通常采用0．5～1．0V／cm电泳过夜，以取得较好的分辨率和整齐的带型。

2．加样。加样时枪头不要碰坏凝胶孔壁，否则DNA带型不整齐。

3．为检查电泳结果，样品中应有对照样品或分子量标准物。

4．EB是致癌物质，应注意防护，紫外光对眼睛有害，观察时应戴上护目镜或防护面罩。

三、PCR技术

PCR是一种在体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增。PCR全过程是基于一套“三”步曲的若干轮次的循环组合而成。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq　DNA聚合酶催化引物延伸（扩增步骤），这三步称为一个循环。PCR方法基于该循环的重复进行，这种酶促反应可将特异性DNA扩增率至少达到2×106拷贝。近年PCR技术得到广泛应用，衍生出许多种PCR相关的新技术，本节主要介绍以DNA为模板的经典PCR技术。

【实验用品】

1．器材　DNA扩增仪、电泳仪、电泳槽、离心机、紫外检测仪、移液器、Tip头、Eppendorf管、照相机等。

2．试剂

（1）引物：用去离子水配成10～50μmol／L浓度，扩增时用量为1～2μl／100μl反应体积。

（2）Taq聚合酶：商品供应一般为5U／μl，扩增时用量为2～5U／100μl反应体积。

（3）PCR反应缓冲液：部分随Taq酶提供给用户，需要时自己配制，10×浓度如下：250～500mmol／L　KCl、100～500mmol／L pH8．4Tris－Cl、15～20mmol／L　MgCl2、0．5%Tween－20、1mg／L　BSA（组分ⅴ）。

（4）dNTPs：已有商品化中性混合液（2mmol，10×）供应，如需要自己配制，则将dATP、dGTP、dCTP、dTTP钠盐各10mg合并，加去离子水2ml溶解，用0．1mmol／L的NaOH调至pH7．0～7．5，分装后－20℃保存（浓度为5mmol／L）。

（5）模板：用合适方法制备的模板DNA。

（6）其他试剂：无菌液体石蜡、琼脂糖、溴化乙锭。

【操作步骤】

1．在一0．5ml　Ep管中加入下列各成分（按100μl反应体积计算）：二种引物各1～2μl、10×PCR反应缓冲液10μl、dNTPs（2mmol／L混合母液）10μl、模板1～5μl、去离子水补至100μl（包括Taq酶体积）。上述诸液混合后，离心15s，使液体沉至管底。加石蜡油30～50μl于反应表面，以防止加温过程中液体蒸发影响反应体积。

2．95～97℃变性5～10min，水浴冷却，加Taq酶（1U／μl）2～5μl，短暂离心。

3．开始循环依据设计的循环参数进行扩增：变性，90～94℃，30～50s；退火，25～65℃，60～90s；延伸，70～74℃，60～120s。反复循环25～35次，末次循环后，在延伸温度再延时5min。

4．反应结果后，短暂离心，吸取少量扩增产物（5～10μl），加1～2μl上样缓冲液，于适当浓度的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。为确定扩增产物是否符合设计要求，需选择合适分子量DNA标准平行电泳。

【注意事项】

1．PCR中的对照设置　为确保结果的可肯定性，应设置阳性及阴性或空白对照，阳性对照为用已知阳性模进行扩增，阴性对照为加无关或不加模板DNA进行扩增。

2．模板制备　DNA提取过程中应注意避免DNA的降解并尽量使DNA中不含任何蛋白酶、核酸酶、Taq　DNA聚合酶抑制剂及能与DNA结合的蛋白质，以获取理想的扩增结果。

3．引物设计与引物浓度　引物是欲扩增核酸片段两端的已知序列，是保证PCR特异性扩增的关键因素。因此，应注意引物设计符合设计的一般原则。否则得不到特异性的扩增带。引物浓度应通过预实验确定最适引物浓度，范围一般在0．2～1．0μmol／L。浓度太低可能得不到扩增结果或产量过低；太高易出现引物二聚体。

4．循环参数　PCR中控制温度是关系到试验成败的重要环节。模板DNA的彻底变性是实验进行的基础，DNA解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。退火的温度及时间依赖于引物的长度、浓度及碱基组成中GC的含量。退火温度太低，易出现非特异扩增。一般来说，退火温度为Tm值减去5℃。PCR中延伸的温度要根据Taq　DNA酶的最适作用温度而定，通常在70～75℃之间；延伸时间则依扩增片段和长度而定，正常情况下，每分钟可延长1kb的长度，如果扩增的片段的150bp左右或更少，可省去此步骤。

四、Southern　Blot法

Southern杂交可用来检测经限制性内切酶酶切后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。其主要步骤包括：基因组DNA的限制性酶切；将DNA片段电泳分离，经变性后转移并固定于支持膜上；预杂交以除去非特异性结合位点；以标记的探针进行杂交；通过放射自显影或显色反应检查目的DNA性酶切片段的位置。

【实验用品】

1．器材　电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、移液器、Tip头、Eppendorf管、尼龙膜、吸水纸、新华3号滤纸、转移槽、水浴箱、杂交炉、离心机、照相机、杂交袋、塑料封口机、X－胶片、X线暗盒、暗室与安全灯等。

2．试剂

（1）限制性内切酶（以EcoRⅠ为例）10U／μl及适合该酶的缓冲液（10×buffer for　EcoRⅠ）。

（2）变性液：0．5mol／L　NaOH、1．5mol／L NaCl。

（3）中和液：0．5mol／L　pH7．4Tris－C、1．5mol／L　NaCl、1mol／L　NH4Ac、0．03mol／L　NaCl。

（4）转移液：20×SSC（配制1　000ml：NaCl　175g，柠檬酸三钠·2H2O　88g，H2O 800ml，1mol／L　HCl调至pH7．0，补水至1　000ml。分装后高压灭菌）；或20×SSPE（配制1　000ml：NaCl　174g，NaH2PO427．6g，EDTA－Na27．4g，H2O　800ml，用10mol／L NaOH调至pH7．4，补水至1　000ml。分装后高压灭菌）。

（5）预杂交液：6×SSC、5×Denhardt（常以50×Denhardt为储备液，配制500ml：Ficoll40　5g，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl　pyrrolidone，PVP）5g，牛血清清蛋白组分Ⅴ，加水溶解至500ml，过滤除菌并存放于－20℃、0．5%SDS、50%甲酰胺、100μg／ml变性断裂鲑精DNA（应在1kb以下，1%琼脂糖凝胶电泳，在溴酚蓝之前；配制时称取10mg，加无菌水1．0ml，加热、超声处理使之溶解，－20℃保存，使用前需煮沸5min变性后迅速放置冰浴）。

（6）其他试剂：0．5mol／L　pH8．0EDTA、双蒸水、0．2mol／L　HCl、放射性标记的探针、显影液与定影液、20%SDS。

（7）样品：DNA样品0．4～0．6μg／μl。

【操作步骤】

1．基因组DNA的限制性酶切　常用30μl反应体积设置反应体系：在一个1．5ml Ep管内加入0．5μg／μl基因组DNA20．0μl、双蒸水5．0μl、10×buffer　3．0μl、EcoRⅠ（10U／μl）2．0μl。离心数秒，使管壁液珠离心到管底，以保证反应体系体积准确。放置37℃水浴保温3～6h；加入1／5体积的0．5mol／L EDTA终止反应（终浓度为12．5mmol／L）。

2．DNA的琼脂糖凝胶电泳　见本节二。

3．DNA的转移与固定　将DNA从凝胶中转移到固相支持膜（尼龙膜）的方法有毛细管转移法、电转移法及真空转移法，这里介绍最常用最经典的毛细管转移法。

（1）电泳结束后照相，然后切去凝胶的边角，并在胶的一角作好标记。

（2）将胶置于0．2mol／L　HCl中处理10min，如果检测的DNA片段＜1kb，可不经此步；如果＞1kb，可适当延长时间（10～20min）。当胶中溴酚蓝由蓝转成橘黄色时，说明胶已处理透。

（3）弃去HCl溶液，用去离子水漂洗2次。随后浸泡于数倍体积的变性液中15～45min后，换用中和液处理15～30min。

（4）按图3－8示安装转移槽，注入足量转移液。

图3－8　典型的毛细胞管作用Southern转移系统

（5）根据胶的大小裁剪尼龙膜及滤纸片（3～5张），同样剪去膜的一角作标志。

（6）将膜平铺在去离子水表面，直到滤膜从下到上湿透为止，然后将其转至转移液中，至少5min，操作时戴手套，用平头镊。

（7）戴手套将在转移液中泡好的滤纸片1～2张铺到转移台上，驱逐气泡。倒上少许转移液，用大小适合的X线片将胶从中和液中托起，将加样孔先接触转移台，自一端起将滑放到滤纸上，注意不要留下气泡。将浸泡好的尼龙膜放在胶上，使膜的上端对齐加样孔。同样检查及排除气泡。放上2～3层预先浸好转移液的滤纸片，放上吸水纸10～15 cm高，上面加一块平板，然后压上0．5kg左右的重物（图3－8）。注意重物使滤纸片、吸水纸之间有较好的接触，发挥毛细胞虹吸作用。

（8）转移持续8～24h，每当纸巾浸湿后更换新的纸巾。小片段转移快，大片段转移需要更长时间。

（9）转移完毕，移去吸水纸，用平头镊将膜取出，在6×SSC溶液中浸泡滤膜5min，用滤纸吸干后夹在两层干净滤纸片中，置于80℃烤0．5～2h。可以紫外灯观察凝胶，检查转移效果。

4．预杂交和杂交

（1）配制所需的适量预杂交液，按每平方厘米杂交膜约需0．2ml计算。

（2）将已转移固定的杂交膜以6×SSC湿润并浸泡2min。

（3）将湿润的杂交膜装入杂交袋中，按0．2ml／cm2加入预杂交液，浸透杂交膜之后，尽可能赶去气泡，以塑料封口机密封袋口，使杂交间隙达到最小，然后置于杂交炉中42℃水浴预杂交2～6h。

（4）将已标记的双链DNA探针于100℃加热5～10min使之变性，然后迅速置冰浴中骤冷。

（5）从杂交炉水浴中取出已经过预杂交的杂交袋，剪去杂交袋一角，通过制品向杂交袋中加入经变性的标记探针。赶尽气泡之后，用塑料封口机重新封口。于杂交袋外再套塑料袋，同样以塑料封口机封口，置杂交炉42℃水浴中杂交6～12h。

（6）小心取出杂交好的滤膜，依下列次序进行洗膜：2×SSC，0．5%SDS，室温5～10min；2×SSC，0．1%SDS，室温，10～15min；0．1×SSC，0．5%SDS，42℃，30min；0．1×SSC，0．1%SDS，56～68℃，30min。

（7）用0．1×SSC于室温短暂漂洗滤膜，将其置于一叠纸巾上，吸去大部分液体，空气中干燥滤膜，以Saran膜包好滤膜，准备进行放射自显影。

5．放射自显影　在暗室中红色安全灯下，按增感屏－X线片－增感屏的顺序放置X线片，盖紧暗盒，置－70℃自显影24h以上，取出后冲洗X线片：室温下将X线片显影3～5min，以背景不过度为宜，清水冲洗之后，置于定影液中5～15min。显影不足者，另放一张X线片，继续自显影5～7d或更长时间。

【注意事项】

1．为使Southern印迹杂交反应获得满意结果，经酶解的DNA量要求在10μg左右。

2．为了及时了解酶反应的完成程度，可在反应到预定时间后，先取1～2μl进行微型凝胶电泳检查，如果酶解不全，可补加少量酶，继续反应2～3h。

3．放射性核素标记有损害性，手上也可能带多种脏物污染X线片，故操作时要戴手套。

4．暗盒放在低温冰箱中应避免震动，以防产生重影。

5．增感屏受污染后会降低效率或使本底升高，应精心保护，及时用乙醇棉球擦净。

五、斑点杂交法

斑点杂交与Southern杂交较为相似，但斑点杂交能简便、快速地检测微量核酸，且可以半定量分析，事先也不用限制性内切酶消化及用凝胶电泳分离核酸样品，在一张固相支持膜上可同时进行多个样品的检测。

斑点杂交的原理是将DNA或RNA变性后直接点样吸附于固相支持膜上，然后用标记探针与之杂交，洗涤去除未反应探针，采用放射自显影或显色反应检测显示杂交信号，分析结果。这里主要介绍用放射性核素标记的探针检测DNA的斑点杂交方法。

【实验用品】

1．器材　移液器、自动光密度扫描仪、Tip头、Eppendorf管、尼龙膜、真空抽滤加样器、水浴箱、杂交炉、杂交袋、塑料封口机、X－胶片、带增感屏的X线暗盒、暗室与安全灯等。

2．试剂　20×SSC、50×Denhardt、10 mg／ml变性断裂鲑精DNA（配制方法见本节三Southern　blot所述）；其他试剂：10% SDS、甲醛、去离子甲酰胺、1mol／L　pH7．0 Na2HPO4、0．5mol／L　pH8．0EDTA、双蒸水、放射性标记的探针、显影液与定影液、DNA样品。

【操作步骤】

1．样膜的制备

（1）样品的预变性：取待测DNA样品的量视情况而定，一般可加样10～20μg，溶于水，煮沸5～10min，冰浴中迅速冷却，使其变性。

（2）尼龙膜的预处理：戴上一次性手套，取尼龙膜按需要剪成合适大小，并剪掉一角作为点样顺序标记。如采用手工点样，用铅笔在尼龙膜上按0．8～1cm2的面积标上小格。用蒸馏水浸湿，再浸入6×SSC溶液中至少30min，将膜取出风干待用。

（3）点样：可根据情况选用手工直接点样或用真空抽滤加样器（斑点或狭缝）点样。手工直接点样时用微量移液器将经变性处理的DNA样品依次点到尼龙膜的标记点上。斑点直径不能过大，应控制在0．5cm2以内。单个样品分少量多次点样，边点样边风干。真空抽滤架器点样时按其操作说明进行点样。

（4）固定：点样后的样膜，置于滤纸上，室温自然风干，然后80℃烤2h固定DNA样品。固定的样膜，封存于塑料袋内待用（－20℃可保存若干月）。

2．预杂交和杂交

（1）配制所需的适量预杂交液，按每平方厘米杂交膜约需0．2ml计算。预杂交液各组分的浓度为：6×SSC、5×Denhardt、0．5% SDS、50%甲酰胺、100μg／ml变性断裂鲑精DNA。

（2）将封存样膜的塑料袋剪一角开口，加少量2×SSC使其湿润，弃余液。按0．2ml／cm2加入预杂交液，尽可能赶去气泡，以塑料封口机密封袋口，然后置于杂交炉中42℃水浴预杂交2～4h。

（3）将已标记的双链DNA探针于100℃加热5～10min使之变性，然后迅速置冰浴中骤冷。

（4）从杂交炉水浴中取出已经过预杂交的杂交袋，剪去杂交袋一角，通过制品向杂交袋中加入经变性的标记探针。赶尽气泡之后，用塑料封口机重新封口。于杂交袋外再套塑料袋，同样以塑料封口机封口，置杂交炉42℃水浴中杂交16～20h。

3．洗膜　小心取出杂交好的滤膜，根据目的序列的丰度、标记探针的要求，可采用高严谨性或低严谨性洗膜。

高严谨性洗膜为：2×SSC，0．1%SDS，室温2次，每次15min；0．1×SSC，0．1% SDS，室温2次，每次15min；0．1×SSC，0．1%SDS，55℃洗2次，每次15min。

低严谨性洗膜为：6×SSC，0．1%SDS，室温2次，每次15min；2×SSC，0．1%SDS，室温2次，每次15min；1×SSC，0．1%SDS，55℃洗2次，每次15min。

4．放射自显影　见Southern杂交。

【结果观察】　根据曝光点（或狭缝）的有无、强弱，可判定目的蛋白的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描条带，计算积分光密度值，可以进行半定量分析。