一、胚胎干细胞的获取和鉴定
胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES细胞）是从着床前胚胎中分离到的一种胚胎性细胞，具有多潜能性和在体外增殖的两个特点。最初由Evans和Kaufman（1981）及Martin（1981）分别从小鼠囊胚内细胞团分离培养成功。由于ES细胞在一般条件体外培养极易分化而失去其多潜能性特点，故须掌握一定的培养技术才能保留其多潜能性和不断增殖的特性。体外建立ES细胞系的条件十分苛刻，既要维持细胞的胚胎性（未分化状态）和多潜能性，又要使其无限增殖，因此需要将ES细胞置于能抑制其分化又能促其生长的培养条件下进行培养。培养液中除必需营养外，还需要细胞生长促进因子，如干细胞因子（SCF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、细胞分化抑制因子如重组白血病抑制因子（LIF）等。培养条件还包括饲养细胞。常用的饲养细胞有小鼠胚胎原代成纤维细胞和小鼠成纤维细胞系STO细胞、3T3细胞、OP9细胞、转入了SCF基因的STO＃8细胞。饲养细胞的作用是提供ES细胞生长的环境和信号，分泌多种细胞因子抑制细胞分化。
建立ES细胞系的方法包括以下过程，①原代ES细胞获得：从受孕动物体内或体外受精卵培养中获得发育至桑椹胚或胚泡阶段的早期胚胎，用机械法分离、胰酶或胶原酶消化桑椹胚或胚泡内细胞团得到原始ES细胞。②ES细胞传代培养：将获得的原代ES细胞转到经放射线照射或丝裂霉素处理的饲养细胞层上进行培养。培养液含适当浓度的胎牛血清（FCS）、非必需氨基酸、2－巯基乙醇、白血病抑制因子（LIF）、干细胞因子（SCF）、碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）和双抗等。细胞培养3～5d，挑取细胞集落，用低浓度胰酶分散后，继续转到新的饲养细胞层上培养，3～5d传代一次。经反复传代培养后，可获得生长旺盛的高纯度ES细胞。③ES细胞鉴定。
由于ES细胞具有多潜能性即可分化发育成不同组织细胞产生不同的功能作用，故广泛用于胚胎发育及组织工程方面的研究，如于培养基中加入不同的分化因子，定向诱导其分化发育成心肌细胞、造血细胞、神经细胞和胰岛细胞等甚至克隆器官；也可以用不同的外源性基因转染ES细胞，将整合有外源性基因的ES细胞注射到宿主囊胚腔内，再移植到假孕母体子宫腔让之发育成个体，从而建立转基因鼠，研究外源性基因的结构与功能以及制备人类疾病动物模型等等。目前，以小鼠ES细胞体外培养技术最为成熟，本文将以小鼠ES细胞为例，较详细讨论ES细胞体外分离培养、ES细胞鉴定及诱导分化。
【试剂材料】
1．ES细胞培养液 以DMEM（高糖，葡萄糖含量在4．5g／L以上）为基础液，加入以下成分：
（1）NaHCO3：2．2g／L。
（2）谷氨酰胺：2mM。
（3）非必需氨基酸：0．1mM。
（4）β－巯基乙醇（β－mercaptoethanol）：0．1mM或单硫甘油（monothioglycerol）：0．15mM。
（5）庆大霉素：50μg／ml或青、链霉素各100U／ml（必要时不加抗生素）。
（6）胎牛血清：15%胎牛血清（FBS）或10%胎牛血清＋10%新生牛血清（NBS）。
（7）LIF：可选择性加入，用饲养层细胞饲养小鼠ES细胞时，可以免加，或加入500～1 000U／ml不等，无饲养层细胞饲养时则要加1 000U／ml以上。用超纯水或五蒸水配制，用HCL调pH 7．4，过滤除菌，4℃保存备用。
目前GIBCO公司出产了一种KD－SR ES细胞无血清培养液，可代替以上培养液使用。
2．STO及MEFs细胞培养液 DMEM（含葡萄糖1．0g／L即可），10%新生牛血清，青、链霉素各100U／ml（或庆大霉素50μg／ml），三蒸水配制即可，过滤除菌，4℃保存备用。
3．胚胎培养液 M16或DMEM（高糖）＋10%NBS＋10%FCS＋青、链霉素各100U／ml。
4．消化液 为胰蛋白酶－EDTA溶液。
胰蛋白酶干粉：2．5g；EDTA：0．4g；NaCl：7．0g；Na2HPO4·12H2O：0．3g；（Na2 HPO4·7H2O：0．18g）；KH2PO4：0．24g；KCl：0．37g；Tris：3．0g；D－葡萄糖：1．0g；酚红：10mg；庆大霉素：4万U（或青、链霉素各10万U）；五蒸水或超纯水：1 000ml；完全溶解后过滤除菌分装，0℃保存备用。
5．冲卵液 M2或无Ca2＋／Mg2＋PBS＋10%新生牛血清＋青、链霉素各100U／ml。
6．0．1%的明胶水溶液 明胶0．1g，超纯水或五蒸水100ml，稍加热溶解，高压灭菌45min，4℃保存备用。
7．丝裂霉素－C STO及MEFs细胞培养液加入丝裂霉素－C 10μg／ml，用前配制，4℃保存不超过1周，且需要避光。
8．LIF 用时加入培养液中，参看ES细胞培养液。
9．孕马血清（PMSG）及绒毛膜促性腺激素（HCG） 用单蒸水配成以下浓度：PMSG：50U／ml，HCG：100U／ml，－20℃保存备用。
10．冻存液 MEFs和STO及ES细胞培养液＋10%～15%DMSO。用时配制或配制后冷冻备用。
11．PBS缓冲液 使用超纯水或五蒸水配制，高压灭菌或过滤除菌。
【仪器设备】
1．CO2培养箱。
2．普通离心机。
3．低温冰箱。
4．液氮细胞保存器。
5．超净工作台。
6．恒温水浴箱。
7．PCR扩增仪。
8．电泳仪。
9．显微注射系统（包括拉针仪、微煅炉和磨针仪）。
【操作步骤】
由于ES细胞极易分化，故既要保持其不断增殖又不要分化，则必须将其饲养在能分泌抑制分化因子的饲养细胞单层上或在培养基中加入抑制分化因子。故ES细胞的分离培养包括饲养细胞培养，饲养单层制备、ES细胞分离培养和ES细胞的鉴定四大部分工作。
1．饲养细胞培养 目前饲养细胞主要有2大类：MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）和STO（小鼠纤维母细胞）及已稳定表达了LIF和neor的STO细胞（如SNL细胞）。
（1）MEFs的制备和培养
①性成熟母小鼠（7～8周龄）与种公鼠（8周龄以上）1∶2比例合笼，每天早上观察母小鼠阴道口，有乳白色或淡黄色冻胶状物（阴道栓）即确定为怀孕。见栓当天为怀孕0．5d。
②怀孕12．5～14．5d的母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫，镊住近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角，提起整个子宫，在灭菌滤纸上吸干血迹，置入盛有PBS或无血清DMEM的平皿内。
③沿子宫系膜侧剪开子宫，摘取胚胎，置入另一盛有PBS或无血清DMEM的平皿内。充分洗涤，去除残余血迹。
④用小镊子撕破胎膜，取出鼠胚，去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干置入另一盛有PBS或无血清DMEM的平皿内。至少洗涤3次，完全去除红细胞。
⑤用灭菌眼科小剪刀或刮胡子刀片将鼠胚躯干剪（切）成1mm3以下的碎块，吸置离心管内。
⑥加入等体积胰蛋白酶－EDTA消化液，轻轻吸吹30s。
⑦加入等体积MEFs培养液终止胰蛋白酶的消化作用，800～1 000r／min 5min离心弃上清液。
⑧加入5ml左右MEFs培养液重悬鼠胚组织，移入培养瓶内（5个鼠胚可使用1个100～150ml培养瓶）让组织悬液能均匀覆盖培养瓶表面（培养液不宜过多），37℃，5% CO2，100%湿度孵箱培养。
⑨培养开始2d不要晃动培养瓶，第3天组织附着培养瓶，表面细胞长出，补充培养液或更换培养液，继续培养。
⑩第4～5天，细胞连成一片，即可消化制成细胞悬液，置离心管内静置5～10min，取上层液即为单细胞悬液，以1∶3比例传代，一般采用3～5代作饲养细胞用。
瑏瑡也可以将鼠胚躯干组织碎块收集离心管后重复下列操作5～6次：加入等体积消化液轻轻吸吹30s→加入等体积培养液终止消化→静置3～5min→收集上层单细胞悬液。最后弃大块组织，将收集到的单细胞悬液离心，800～1 000r／min 5min弃上清，加入培养液，分装培养瓶皿，37℃，5%CO2，100%湿度孵箱培养。每天观察，及时更换培养液和传代，同样以1∶3比例传代，3～5代作饲养细胞用。
（2）STO细胞的培养：STO细胞是SIM小鼠纤维母细胞的一种耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系细胞，广泛用作多潜能畸胎瘤细胞和ES细胞的饲养细胞，其代替MEFs的优点是：细胞易于生长及不需要经常准备怀孕母鼠，但STO细胞必须保持在最适生长条件下，否则易于变异，特别是生长密度过大时。目前已有稳定转染了neor基因和LIF基因的STO细胞株（如SNL细胞），可用于ES细胞的转染和筛选。STO细胞的培养按一般细胞株的培养方法即可，培养液与MEFs相同。
2．饲养单层制备 有2种方法：丝裂霉素处理法和γ－射线照射法。一定剂量的丝裂酶素和γ－射线能够使细胞停止分裂，但又不至于马上死亡，在体外可维持一段时间生命。故可利用其处理饲养层细胞使饲养层细胞不分裂，又能存活并分泌抑制ES细胞分化和促进ES细胞增殖的因子，保证ES细胞的生长。
（1）丝裂霉素处理法
①MEFs或STO细胞融合成单层，弃培养液，加入含10μg／ml丝裂霉素－C溶液（覆盖细胞单层即可），37℃，5%CO2，100%湿度孵箱内放置2～3h。
②弃丝裂霉素处理液，用PBS充分洗涤3～5次，除去残余丝裂霉素－C，因其能影响ES细胞的生长。
③消化液消化制成3×105个／ml浓度的细胞悬液，种植到预先用0．1%明胶处理过的培养瓶或培养皿内（0．1%明胶覆盖培养瓶或培养皿表面，室温放置2h以上，用前吸弃多余明胶，直接使用或稍干燥后使用）。也可以种植到未用明胶处理的一次性塑料培养瓶内。
④37℃，5%CO2，100%湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。细胞如果过稀可补加丝裂霉素处理过的细胞，这样制成的饲养单层可使用6～10d，用前更换ES细胞培养液。
⑤MEFs或STO细胞单层用丝裂霉素处理及PBS洗涤以后，也可以不消化直接使用。
（2）γ－射线处理法
①MEFs或STO融合成单层后，用γ－射线照射，剂量为30～100Gy（3 000～10 000rad）。余下步骤同丝裂霉素－C处理法③～⑤。
②射过的细胞也可以以5×106个／ml浓度冻存备用。
3．从小鼠囊胚内细胞团分离培养原代ES细胞
（1）3．5d怀孕鼠的准备及3．5d胚胎采集
①性成熟前期母鼠（昆明鼠大约4周，24～26g最好）于中午11：00～1：00或下午4：00～6：00腹腔注射孕马血清（PMSG），5～10U／只。
②间隔46～48h腹腔注射绒毛膜促性腺激素（HCG），5～10U／只鼠，同时以1∶1比例与种公鼠合笼。
③第2天上午观察母小鼠阴道栓，见栓者当天为怀孕0．5d，见栓第4天为怀孕3．5d。
④怀孕3．5d母鼠断颈处死，无菌条件下打开腹腔，暴露子宫。
⑤镊住近子宫颈端，剪断，分离子宫系膜，并于输卵管端剪断子宫角。
⑥小鼠为双侧子宫，分离后的子宫用无菌滤纸吸干血迹后置于无菌平皿内（直径35mm）。
⑦1ml灭菌注射器吸入冲卵液，从子宫角端进针。针头要保证进入子宫腔内。将冲卵液快速推入子宫腔（0．2～0．5ml／侧子宫）。胚胎连同冲卵液从子宫颈端排出。要注意用平皿接好排出的冲卵液。
⑧将盛有胚胎冲卵液的平皿置于显微镜下（25～100倍），仔细采集胚胎。3．5d胚胎一般处于囊胚期，但也可能处于桑椹期，均可使用。
（2）胚胎培养
①用胚胎培养液在直径35mm平皿内做成小滴。每个直径35mm平皿可做成4个小滴，上覆盖透明石蜡油。
②将收集的3．5d胚胎置入培养小滴内，37℃，5%CO2，100%湿度孵箱内培养。
③每天观察，换液1～2次／d。
④待胚胎发育为囊腔充分扩展或突破透明带时移植到MEFs或STO饲养单层（用直径35mm培养皿准备，上覆盖透明石蜡油）上继续培养。此时换上ES细胞培养液。
⑤1～2d后，胚胎贴附在饲养单层上；进一步，滋养层细胞扩展开并形成薄薄一层，将饲养层细胞推开，内细胞团位于中央向上隆起生长，边缘界线清晰，表面较光滑，结构致密；3～5d内细胞团块增大，即可作内细胞团分离和早期细胞培养。此期间要隔天更换培养液。
（3）ES内细胞团细胞分离培养
①细吸管的准备：毛细吸管一端在火焰上拉细，用砂轮将末端切断，准备末端口径比内细胞团稍大或稍小两种。
②将内细胞团生长良好的培养皿置于显微镜下（25～100倍），用末端口径比内细胞团块稍大的毛细吸管挑起内细胞团，收集到覆盖有透明石蜡油的培养小滴内（用ES细胞培养液制备）。
③将内细胞团块收集齐后，一同置于覆盖有透明石蜡油的胰蛋白酶－EDTA消化液小滴内，用消化液洗涤1次，弃除残余培养液，加入新的消化液，37℃作用3～4min。
④改用末端口径比内细胞团块稍小的毛细吸管，轻轻吸吹内细胞团块，至分散成2～4个细胞在一起的小团块。
⑤将内细胞团细胞吸至MEFs或STO饲养单层上（预先用丝裂霉素－C或γ－射线处理），换上ES细胞培养液。每天观察，2d后，可见ES样细胞小集落出现，3～4d集落进一步增大，可按ES细胞培养方法进行消化传代。
4．ES细胞的传代培养
（1）饲养层培养法
①将ES细胞种植到用丝裂霉素－C处理或γ－射线照射后制成的饲养单层上，换上ES细胞培养液。
②于37℃，5%CO2，100%湿度孵箱内培养，每天观察，及时更换培养液，每2～3d以1∶3至1∶6的比例消化传代。
③消化时，弃培养液，PBS洗涤1次，加入胰蛋白酶－EDTA消化液，以能覆盖细胞表面为度，之后放在倒置显微镜下观察，见ES细胞克隆内部细胞界线清楚时既带消化液轻轻吹打细胞，直至ES细胞克隆成为大部分是单细胞时马上加入培养液终止消化。
④将ES细胞悬液吸至离心管，以800～1 000r／min进行离心。
⑤离心后的细胞用培养液重新悬浮，吸至培养瓶内并加足培养液于37℃，5%CO2，100%湿度孵箱内进行培养。
⑥正常的ES细胞集落应该是：边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，碱性磷酸酶检查强阳性。若饲养条件不适ES细胞易于分化，集落变得扁平，边缘不清楚，表面粗糙，见有较大内胚层样细胞结构，碱性磷酸酶检查阴性。
（2）无饲养层培养法
①LIF的使用：于ES细胞培养液中加入LIF，浓度1 000U／ml即可在无饲养层下培养ES细胞。
②Buffalo大鼠肝细胞（BRL）条件培养基（BRL－CM）的使用：BRL是一种细胞株，能分泌LIF，故收集其上清可用于ES细胞的培养。方法是：以2×105个／ml浓度种植细胞，培养72h，收集上清，使用的培养液为不加LIF的ES细胞培养液。培养上清使用前过滤弃细胞碎片。使用时，6～7份培养上清加3～4份新鲜不加LIF的ES细胞培养液，再加入8%～10%胎牛血清，组合成BRLCM。使用BRL－CM培养ES细胞不加饲养层，同LIF一样可保持ES细胞未分化性和多潜能性。
③大鼠心肌条件培养基（RH－CM）的使用：2～3周龄大鼠的心肌细胞培养上清也有BRL培养上清相类似的作用。方法是：将2～3周龄的大鼠心肌制成单层细胞，以1∶2传代，收集5代内的培养上清。所用的培养液为不加LIF的ES细胞培养液。培养上清使用前过滤弃细胞碎片，使用时，6份培养上清加3份新鲜不加LIF的ES细胞培养液，再加1份胎牛血清，组合成RH－CM。
④ES细胞无饲养层培养：传统的方法如下。
A．用明胶预先处理培养瓶：0．1%明胶水溶液覆盖培养瓶或培养皿表面，室温放置2h以上，用前吸弃多余明胶，直接使用或稍干燥后使用。
B．已培养2～3d、生长旺盛的胚胎干细胞克隆消化成单细胞悬液。消化方法同前。
C．1∶3至1∶6比例转种到用明胶预先处理过的培养瓶内，添加条件培养基。
D．37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内继续培养。改进的方法是：使用一次性塑料培养瓶进行培养。培养瓶不需要用明胶预处理既可直接使用。其他步骤同传统的方法。
⑤无饲养层培养的ES细胞，呈岛屿状生长，克隆的特征性形态更清楚。
5．ES细胞的冻存与复苏 方法同一般细胞株的冻存和复苏方法，冻存液则是在培养液的基础上加10%～15%DMSO。最好用时配制。复苏溶解后一定要尽快加培养液稀释冻存液减少DMSO对细胞的毒性作用，800～1 000r／min 5min，离心，弃上清，加培养液重新悬浮进行培养。
6．ES细胞的鉴定 ES细胞是一种正常的胚胎性干细胞，具有正常的二倍体核型、体内外分化能力及整合到宿主内细胞团并共同发育成嵌合个体的能力，但其易分化变异，引起这些能力的减弱甚至丧失，故ES细胞体外培养时间久以及内细胞团细胞一旦消化传代时都要及时进行ES细胞核型的鉴定及体内外分化能力及嵌合能力的观察，拟评定ES细胞进一步应用的价值。
（1）细胞表面标志鉴定
①碱性磷酸酶染色呈强阳性。
② 显示高水平的端粒酶活性。
③表达胚胎特异性抗原SSEA－1、SSEA－3、SSEA－4、TRA－1－60和TRA－1－81等。以常规的免疫组化方法进行鉴定即可。
（2）核型鉴定：参照细胞系（或株）的建立和鉴定的相关资料。结果显示正常的核型。
（3）体外分化能力观察
①ES细胞按常规方法消化，但不要吹打成单细胞悬液而让其保持团块状。
②移置无饲养层培养瓶（皿）内，培养液中不加LIF，胎牛血清浓度降至10%。
③按常规培养条件培养，但每天轻轻晃动培养瓶（皿）或用吸管吹打2～3次／d，不让ES细胞团块贴壁和粘连在一起，必要时换部分培养液。
④每天观察，一般3d左右，ES细胞团块开始分层，外部一层是较大的内胚层样细胞，内部细胞小而紧密，为外胚层样细胞和干细胞。此时为简单类胚，培养至5～10d，分层增多，并逐渐出现囊腔，最终细胞团涨大成圆泡状，为囊状胚。
⑤如果细胞团贴壁也可以分化，长出如上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞等多种细胞，将这些细胞团挑出固定，可初步了解其分化时间和能力的强弱。
⑥不同的ES细胞，分化能力不同，根据其分化程度的不同，可初步了解其分化能力的强弱。
（4）体内分化能力的观察
①生长良好的ES细胞，按常规方法消化制成单细胞悬液，计算细胞总数。
②500～1 000r／min，5～10min离心弃上清。
③加入少量培养液，调成高浓度细胞悬液（约1×108个／ml）。
④取同种小鼠，腹股沟注射ES细胞高浓度悬液，每只鼠约1×107个细胞。或接种裸小鼠腹股沟皮下，1×106个细胞／只鼠即可。
⑤小鼠接种细胞后放回笼内饲养，约2周后腹股沟注射处出现肿块，4～5周后，肿块进一步增大，处死小鼠，摘除肿块。
⑥肿块一部分固定，切片，染色，观察；另一部分消化制成单细胞悬液（方法同MEFs的制备）体外培养。继续观察，切片中可见属于各个胚层的组织分化，如各种上皮组织、神经纤维、角质化的复层扁平上皮、肌肉组织、软骨、硬骨、腺腔、神经管以及干细胞巢等，为畸胎瘤结构，恰如将小鼠胚胎异位移植后的结果。体外培养的细胞见有多种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、成纤维细胞、心肌细胞以及干细胞集落等。
⑦也可以腹腔注射，剂量同腹股沟接种。见小鼠腹部逐渐胀大，2～3周后，处死小鼠，打开腹腔，也见大小不一畸胎瘤肿块，游离或粘连在肠系膜上。同样可摘除固定、切片、染色以及体外培养，观察结果同上。
（5）嵌合能力的观察：将ES细胞注射到宿主囊胚腔内，其能融合到宿主囊胚的内细胞团内共同发育成个体（嵌合体）。来源于不同动物品系的ES细胞，有不同的遗传特点，通过这些遗传特性的观察，可确定ES细胞是否整合、分化、发育。目前最常用的方法是对新生个体毛色的观察。
①确定ES细胞的来源及选择宿主鼠品系：大多数ES细胞来源于129品系小鼠。129小鼠毛色为野灰色，应选择白化体鼠（如BALB／c）和非野灰色鼠（如C57BL／6），也有来源于C57BL／6鼠的ES细胞，则应选白化体鼠（如BALA／c）和野灰色鼠（如129鼠），产生的嵌合体应是花色鼠，被毛是白色和野灰色或黑色相间，眼睛虹膜为野灰色或黑色。
②准备为3．5d受体囊胚（同前）。
③生长良好的ES细胞消化制备成单细胞悬液。
④应用显微注射仪将ES细胞注射到受体囊胚腔，10～15个ES细胞／囊胚。
⑤将注有ES细胞的囊胚移植到假孕母鼠子宫腔，让之发育并产下个体并鉴定嵌合情况。
【关键技术问题】
1．ES细胞培养液 用于培养ES细胞的培养液比较特殊，需要使用高糖的DMEM，葡萄糖的浓度要在4 500mg／L以上；要加上抑制细胞分化的巯基乙醇（0．1mmol／L）或单硫甘油（0．15mmol／L），有时还加丙酮酸钠（1mmol／L）、谷氨酰胺（2mmol／L）、非必需氨基酸（0．1mmol／L）和LIF。血清浓度也较高，用10%胎牛血清＋10%新生牛血清或者用15%～20%胎牛血清。碳酸氢钠的用量2．2g／L比3．7g／L可能效果更好。培养液的配制必需使用无细菌内毒素污染的超纯水或五蒸水。细菌内毒素是一种脂多糖，是革兰阴性菌的细胞壁成分，很低浓度也会影响ES细胞的增殖，离子交换柱使用时间久，细菌会生长在树胶的表面并释放内毒素到过柱的超纯水中，故用玻璃蒸馏水器制备的五蒸水可能比用离子交换柱制备的超纯水要好。超纯水和五蒸水要现用现制备。目前GIBLO公司出一种无血清ES细胞培养液，可代替传统的培养液。血清成分复杂，不利于整合到ES细胞基因组中的外源性基因功能的测定，所以在ES细胞应用中无血清培养基会更好。
2．消化液及细胞消化 使用胰蛋白酶、EDTA和无Ca2＋／Mg2＋磷酸缓冲液的混合体作为消化液。ES细胞之间结合较一般细胞紧密，使用的胰酶和EDTA的浓度都较一般消化液高，一般使用的浓度是：胰酶0．25%，EDTA 0．04%，胰酶的浓度甚至可高达0．5%。消化传代时，一定要将ES克隆消化成单个细胞，多细胞黏附在一起的团块易于分化。
3．血清 使用胎牛血清作为ES细胞培养液的组成部分。选择一批最适于ES细胞生长的胎牛血清很重要，一旦确定最好批次，最好储备同批足量血清备用。可用平板效率实验（plating efficiency）测定血清效果：消化ES细胞，调成较低浓度种植到平皿内（每6cm平皿最多种植1×103cells），培养液加入待测血清，每批血清设定5～6个平皿。另设置一平皿测定血清毒性（血清加至30%浓度）。培养7～10d，当肉眼可见ES细胞克隆时，去培养液，用PBS洗涤ES细胞，2%亚甲蓝（methylene blue）染色2～5min，检测克隆的形态，平板效率应在5%～10%。
4．LIF LIF（Leukemia inhibitory factor）也称DIA（differentiation inhibiting factor）是一种能抑制ES细胞自发性分化的分泌型多肽细胞因子，正常的STO及稳定转染了LIF表达质粒的STO细胞皆能分泌LIF。纯化的LIF完全能代替STO细胞及小鼠胚胎成纤维细胞，ES细胞转染外源性基因时可以不使用饲养层，而培养基中加入LIF，但LIF很昂贵。此外饲养层细胞除了分泌LIF外，也许还分泌另外一些能促进ES细胞增殖的因子，故许多的实验室继续使用饲养细胞。
5．MEFs 使用MEFs的最大优点有二：来源丰富以及早期培养除了能产生抑制ES细胞分化的因子外，也产生一些促ES细胞生长的因子。但使用MEFs也有如下几方面缺点：①其生命周期有限，不能长久传代；②培养代数增多，其分泌抑制分化因子和促生长因子能力减弱，甚至消失，在3～5代时使用最为理想；③无耐药性，不能用于外源性基因转染的ES细胞筛选，筛选时可用整合有neor基因的STO细胞以及培养基中加入LIF代替MEFs。制备MEFs的小鼠任何品系都可以，但胎数最多的是远交系及F1代小鼠。MEFs和STO单层制备时，种植的细胞密度很重要，建议使用以下的密度：STO 5×104／cm2，MEFs则是STO的1．5～2倍即7．5×104／cm2～1×105／cm2。饲养单层使用前要检查是否完全铺满培养皿底。
6．石蜡油 内细胞团细胞早期培养使用到石蜡油。有些研究者认为使用前不需要高压灭菌，因为高压灭菌可能会增加毒性。胚胎培养实验中覆盖有透明石蜡油可以维持培养液的离子浓度以及减少污染的发生。回收使用的石蜡油则要高压灭菌后使用；另外，每批石蜡油使用前要作毒性检查：胚胎培养观察胚胎发育情况甚至观察培养后胚胎移植情况。
7．支原体的检查 ES细胞、饲养层细胞要定期作支原体污染检查。
8．ES细胞培养方法 饲养ES细胞的方法分有饲养层培养法和无饲养层培养法，皆能很好维持ES细胞未分化性和多潜能性，但饲养层细胞会影响整合到ES细胞基因组中的外源性基因功能的测定，而且无饲养层培养免去了饲养层细胞培养和饲养单层制备的繁琐工作，故无饲养层培养法可能会比有饲养层培养法更佳。
二、胚胎干细胞的诱导分化
（一）ES细胞分化研究的理论基础
自1988年肯定了白血病抑制因子（LIF）能抑制ES细胞分化后，人们就开始研究其定向分化。通过将外源基因转入ES细胞研究其表达及微环境对细胞分化的影响，认为ES细胞的分化受内源性因素和外源性因素的共同调节。内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和关闭及各种转录因子等。外源性因素指细胞间的分化诱导、分化抑制作用及细胞外物质的介导作用等。
1．内源性因素 从分子水平来看，ES细胞分化的本质问题是基因表达调控。丛笑倩等对外源转化生长因子－β（TGF－β）基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化影响的研究中指出，TGF－β蛋白的增加改变了ES细胞周围的微环境，诱导内皮和血管样结构的产生。Michael等利用心肌细胞－肌球蛋白重链的启动子转染ES细胞，获得99%的心肌细胞。Pevny等将神经元专一转录因子SOX2基因转染ES细胞，得到90%以上的表达神经元标志的神经细胞。Cross和Enver应用单个细胞RT－PCR分析法及谱系限定的转录因子共表达的分析，证明细胞定型时是通过强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型。不同基因表达的产物在不同细胞中有质和量上的差别，如红细胞表达血红蛋白，淋巴细胞表达免疫球蛋白，结缔组织细胞表达胶原等。基因的选择性表达导致细胞分化。
2．外源性因素
（1）分化诱导：是指通过ES细胞间的相互作用，使ES细胞发生定向分化的过程。提供或传递刺激的ES细胞称诱导细胞，接受刺激并发生反应的ES细胞称反应细胞。按作用机制分为接触性和非接触性诱导。前者通过表面接触和缝隙连接引起基因活动和代谢变化或沟通细胞间的信息交换而起作用；后者通过诱导细胞产生大分子物质，在细胞外基质中形成浓度梯度或扩散到反应细胞，诱导定向分化。通过进行性的细胞间相互作用，完成一系列的分化和发育。
（2）分化抑制：完成分化的细胞可以产生抑素，可抑制邻近细胞进行同类分化，这种作用称为分化抑制。把正在发育的蛙胚置于含成体蛙心组织的培养液中培养，蛙胚不能发育成正常的心脏。成体蛙心对蛙胚心脏发育的抑制作用即分化抑制。
（3）细胞外物质的介导作用：细胞外物质的介导作用分近距离与远距离两种。起近距离介导作用的主要是细胞外基质与黏附分子，起远距离介导作用的主要是激素与细胞因子等。
（二）ES细胞的分化研究现状
由于ES细胞具有分化的多潜能性和在体外增殖的能力，故具有细胞治疗和组织工程种子细胞的应用价值。但是，人类对ES细胞分化和组织器官的发生发育的分子机制知之甚少，因此目前对ES细胞的应用仍处于早期的基础研究，以明确决定细胞分化的基因表达时空关系和外界刺激因子，在此基础上定向诱导产生需要的功能细胞或器官，用于临床细胞治疗与组织工程。ES细胞的分化研究分为诱导一般分化和定向分化两类。前者是指加入一定的分化诱导剂，常用的是全反式维甲酸（AtRA），ES细胞同时或先后分化出不同类型的细胞。这反映了ES细胞不受约束的自我无序发育，实际应用意义不大。目前主要是从培养方式的改进、分化诱导剂的选择和针对不同的终末靶细胞方面着手，研究ES细胞的定向分化。
1．向神经细胞的定向分化 最近，有学者将小鼠的ES细胞置于仅含成纤维生长因子－2（FGF－2）的培养基中增殖，然后加入血小板生长因子（PDGF），在两者的混合液体培养基中，这些多能细胞维持多代而不分化，得到表达神经胶质前体标志分子的纯的多能祖细胞。当除去FGF－2和PDGF后，这些细胞最终只向着少突神经胶质细胞或星形神经胶质细胞分化。Vogel等将人ES细胞培养至拟胚体（embryoidbodies，EBs）后，用神经细胞培养基（常规培养神经细胞的培养基）培养，分离出部分分化的EBs在含碱性成纤维生长因子（bFGF）的培养基中培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。这是一种将人ES细胞定向分化为神经上皮细胞的有效方法。
2．向造血细胞的定向分化 当用骨髓基质细胞或其条件培养基培养ES细胞时，可定向诱导造血干细胞的分化。Faloon等从体外培养的ES细胞得到BL－CFCs－造血细胞及内皮细胞的共同的前体细胞，即hemagioblast。bFGF介导的信号对hemagioblast的增殖起关键作用，说明bFGF也可诱导ES细胞向造血干细胞分化。转录因子GATA－1对正常红细胞的生成是必须的。缺失GATA－1则红系祖细胞不能分化为成熟的红细胞而走向凋亡。Gregory等的研究表明GATA－1导致抗凋亡蛋白bcl－xl的表达，体外培养bcl－xl阴性ES细胞不能生成成熟的红细胞，与GATA－1基因功能缺失相似。Era和Witte在研究多系谱血细胞分化及胚胎干细胞向造血细胞分化过程中发现，Bcr－Abl单独表达就能有效的地增加多能和髓系祖细胞的数量并呈剂量依赖关系，而抑制红系祖细胞的发育。
3．向内皮细胞的定向分化 在小鼠体内实验中，发现转化生长因子－β1（TGF－β1）能快速诱导血管生成。体外实验中也观察到其促胶原蛋白形成的作用。姚鑫等人用TGF－β1基因转染小鼠ES细胞，建立该基因过度表达的细胞克隆，用RA诱导分化后，可使95%以上EBs产生大量内皮细胞的前体细胞，以后迁移分化形成血管样结构。在重组TGF－β1EBs细胞中，能检测到bFGF，提示TGF－β1蛋白的增加会改变ES细胞分化的微环境，诱导内皮细胞和血管样结构的产生。
（三）向其他细胞定向分化的研究
1．由小鼠ES细胞向其他细胞定向分化
小鼠ES细胞在骨髓基质细胞及IL－3、IL－6、IL－7的共同作用下，分化为T、B淋巴细胞的前体细胞；与M－CSD和IL－1、IL－3共同作用时分化为巨噬细胞；在RA、T3及胰岛物的共同刺激下分化为脂肪细胞；与RA和dbcAMP的共同作用时分化为血管平滑肌细胞；在RA及DMSO的刺激下生成心肌细胞；从培养形成的EBs中富集nestin阳性细胞，在含bFGF的N2无血清培养基中进行扩增，去除bFGF后，分化出表达insulin和其他胰腺内分泌激素的类胰岛细胞并能自我组装形成类胰岛结构，这些类胰岛细胞能够分泌少量胰岛素。
2．由蛙ES细胞向其他细胞定向分化浅岛诚等用Aetivin可诱导蛙ES细胞向心肌、肝和红细胞分化。
3．由人ES细胞向其他细胞定向分化有研究小组将人ES细胞置于含丁酸钠的培养基中培养，当大多数细胞死亡后，换用肝细胞培养基（常规培养肝细胞的培养基）培养存活细胞，其中许多细胞开始储存糖原并表达肝细胞特异性蛋白。
（中山大学医学院 陈系古 黄 冰 潘兴华）
参 考 文 献
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