真皮成纤维细胞

成纤维细胞是结缔组织最主要的细胞成分，在分泌细胞外基质成分及构建细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中也发挥着重要的作用。成纤维细胞具有较强的分裂增殖能力，是最容易培养的动物细胞类型之一。

成纤维细胞体外培养技术目前比较成熟。常用的原代培养方法有组织块贴壁培养法和酶消化法。

一、材　　料

1．皮肤来源　一般采用外科手术切除下的包皮、乳房或腹部皮肤。如果不能马上把标本送入细胞培养室，可在培养液中4℃保存2～3d。

2．培养液

（1）成纤维细胞培养液：DMEM培养基，添加10%胎牛血清、4mM谷氨酰胺以及100U／ml青霉素和100μg／ml链霉素。

（2）皮肤标本储运液：DMEM培养基，添加10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素、2．5μg／ml两性霉素和50μg／ml庆大霉素。

3．其他培养用液

（1）PBS液：无钙镁磷酸盐缓冲液，成分为1%（W／V）NaCl，0．025%KCl，0．144% Na2HPO4，0．025%KH2PO4，调整溶液的pH为7．2，高温、高压消毒灭菌，室温下储存备用。

（2）胰蛋白酶－EDTA消化液：将0．25%的胰蛋白酶溶液和0．02%的EDTA溶液按1∶4（V／V）的比例配制。

（3）中性蛋白酶（dispase）液：用无血清DMEM培养基配制，浓度为2mg／ml，过滤消毒，即配即用。

（4）I型胶原酶溶液：用PBS液配制，浓度为0．1%，过滤消毒，即配即用。

4．培养器皿　培养瓶、培养皿和各种手术用刀、剪等。

二、酶消化法原代培养

1．将外科手术切除下的皮肤置入皮肤标本贮运液中。

2．在超净工作台内取出标本，在75%乙醇中快速浸洗3次。

3．用剪刀剪去皮下脂肪组织，并将标本修剪成宽2～3mm的条状。

4．用PBS漂洗2次，将皮片浸于中性蛋白酶（dispase）液中4℃过夜或37℃下消化2～4h。

5．从中性蛋白酶消化液中取出标本，将其放入另一培养皿中，用两把眼科镊子将表皮与真皮分离开。

6．用眼科剪刀将真皮片剪碎，移入50ml离心管中。

7．加入0．1%的胶原酶溶液消化剪碎的真皮，37℃下振荡4h左右。

8．待消化液已显浑浊，停止消化。经150目不锈钢滤网过滤消化液，收集细胞悬液。

9．用培养液重新悬浮细胞，依上述条件再离心1次。

10．用培养液重新悬浮细胞，制备细胞悬液。苔盼蓝染色计数。以（1．5～3）×104个细胞／cm2的密度接种到培养瓶或皿中。在37℃，5%CO2，100%相对湿度的培养箱中培养，培养液3d换1次。一般原代培养10d左右细胞生长至75%融合时即可进行传代培养。

三、组织块法原代培养

1．重复酶消化法原代培养步骤1～5。

2．将真皮片转移到装有少量培养液的培养皿中，用眼科剪刀将真皮片剪切成1mm3的小块。

3．用吸管将真皮植块及少量培养液移入培养瓶中。将真皮植块按0．5cm左右的间距均匀放置在培养瓶底部生长面。小心翻转培养瓶，使组织块处于“悬滴”状态，拧紧瓶盖，在37℃，5%CO2，100%相对湿度的培养箱中。

4．孵育培养4～6h后，将培养瓶取出，瓶底仍朝上。向瓶内加入1～2ml培养液，慢慢翻转培养瓶，让培养液缓缓覆盖真皮植块，尽量防止植块漂浮起来。在培养箱中继续培养24h。

5．检查培养物，确认植块已经黏附于培养瓶底部后，再加入适量培养液，以后培养液每3～5d换1次。

6．在倒置显微镜下观察培养物，当迁出的成纤维细胞汇合成片、覆盖大约75%的生长面时，即可进行传代培养。

四、传代培养

1．用吸管吸尽培养液。对于组织块培养，先要用镊子或吸管取出植块。然后用PBS液冲洗2次。

2．加入胰蛋白酶－EDTA消化液，液量以刚能覆盖培养瓶底部即可，轻轻摇动培养瓶。3～5min后，在倒置显微镜下观察，当大部分细胞开始收缩变圆时，慢慢倾斜培养瓶，用吸管吸去消化液。

3．加入含血清的培养液终止胰蛋白酶的消化作用。用吸管吸取培养液，反复吹打瓶底，使细胞与瓶底分离，并分散为单个细胞悬液。

4．苔盼蓝染色计数，根据实验需要用培养液调节细胞密度。在单纯细胞扩增时，可直接以1∶3或1∶4的比例进行分瓶培养。培养液3d换1次，细胞生长至75%融合时再进行传代。

（上海第二医科大学第九人民医院　崔　磊　杨光辉）