材料的本体性能检测

一、组成和结构

生物材料的组成和结构方面的检测技术主要有红外和拉曼光谱、核磁共振谱、紫外和可见吸收光谱、质谱和X线衍射等。下面分别介绍它们的基本原理及其在生物材料研究中的应用。

1．红外和拉曼光谱　红外（Infrared缩写为IR）光谱是物质在波长为0．7～1　000μm的红外光辐射作用下分子振动能级跃迁而产生的，由于同时伴有分子转动能级跃迁，因而红外光谱又称振－转光谱。拉曼（Raman）光谱是一种散射光谱，它是研究波长为几百纳米（nm）的可见光与物质的相互作用。由于激光具有单色性好、方向性好、亮度高等特点，因而以激光为光源的激光拉曼光谱分析已成为材料分析的重要方法。

红外和拉曼光谱在生物材料的研究中占有十分重要的地位，它们是研究和表征生物材料的化学和物理结构的基本手段之一，通过它们可以对生物材料的化学组成和结构、构象、空间立构、凝聚态结构、取向结构以及生物高分子材料的聚合过程、结晶过程、物理老化和降解机制等进行研究，下面将举例说明它们在生物材料领域中的主要应用。①分析和鉴别材料的组成和结构：红外光谱法操作简单，谱图的特征性强，因此是分析和鉴别材料结构的一种理想的方法，它不仅可以区分不同类型的材料，对于结构相近的某些材料也可以很好地区别。如聚乳酸（PLA）和聚羟基乙酸（PGA）均为聚酯类材料，均表现出在1　750cm附近有强的酯羰基特征吸收峰，但由于聚乳酸分子链中存在侧甲基，它们在1　300～1　500cm处表现出来的吸收峰是不同的，聚乳酸的红外光谱上1　455cm和1　380cm处对应有－CH－和－CH3基团的弯曲振动峰，而聚羟基乙酸的红外谱图上1　420cm处有来自－CH2－的弯曲振动峰。据此可以鉴别这两种聚酯材料。②共聚物组成和结构研究：共聚物的性能和共聚物中不同结构单元的结构、组成和序列有很大的关系，有关它们的信息均可通过红外光谱得到。如研究乙交酯和丙交酯的共聚合反应时，可以通过测定共聚物的红外光谱上1　420cm处吸收峰的强度变化来推断共聚物的组成和序列结构。③结晶性材料的研究：采用红外光谱法可以对材料的结晶度、结晶动力学以及结晶形态等进行研究。如在研究水热法合成的羟基磷灰石（HA）的结构时，通过观察HA的红外光谱上1　400～1　500cm－1处CO32－的特征吸收峰为单峰或双峰，可以判断等边三角形CO32－对四面体形状PO43－是否发生了替换而引起晶格畸变。

2．核磁共振谱　核磁共振谱与红外光谱一样，也是一种吸收光谱，它的频率是兆周（MC）或兆赫兹（MHz），属于无线电范围。核磁共振是利用具有核磁矩的原子核作为探针来探测分子内部局部磁场的情况，而这一局部磁场的大小以及随着各种因素的变化正反映了分子的内部结构，以及各个分子之间的排列情况，因此，核磁共振是研究不同物质的分子内部结构、动态结构以及环境对分子结构的影响和物理性质的有力工具。

NMR谱按照测定对象分类，可分为：1　H－核磁共振谱（氢谱）、13　C－核磁共振谱（碳谱）以及氟谱、磷谱、氮谱等。其中以氢谱和碳谱的应用最为广泛。

（1）1　H－核磁共振（1　H－NMR）在生物材料研究中的应用：1　H－NMR也称为质子核磁共振，是研究化合物中1　H原子核（即质子）的核磁共振。从1　H－NMR可提供化合物中氢原子所处的不同化学环境和它们之间相互关联的信息，依据这些信息可确定分子的组成、连接方式及其空间结构等。例如在研究聚（丙交酯／乙交酯）（PLGA）共聚物的分子组成时，共聚物的1　H－NMR谱图显示在化学位移（δ）为1．6ppm、5．2ppm和4．8ppm附近有三组质子共振峰，它们应分别为共聚物中－CH3、－CH－和－CH2－基团上的质子共振峰，且根据5．2ppm和4．8ppm质子共振峰的相对强度可计算得到共聚物的化学组成。

（2）13　C－核磁共振（13　C－NMR）在生物材料研究中的应用：13　C－NMR是研究化合物中13　C核的共振状况，对于研究化合物中碳的骨架结构，特别是在高分子结构分析中，研究碳的归属是很重要的，如确定物质的分子结构、测定高分子的立构规整性、研究高分子的支化结构以及共聚物的组成和序列分布等。例如从PLGA共聚物的13　C－NMR谱图上－G－（乙醇酰）结构单元和－L－（乳酰）结构单元中的酯羰基C的共振峰均发生了分裂，则可说明共聚物分子链中存在不同的结构序列，且从各共振分裂峰的相对强度可计算得到共聚物分子链中－GG－和－LL－序列的平均长度。

3．紫外和可见吸收光谱　紫外、可见吸收光谱是物质在紫外、可见光辐射作用下分子外层电子在电子能级间跃迁而产生的，故又称为电子能谱。当样品分子吸收光子后，外层电子由基态跃迁到激发态，不同结构的样品分子，其电子的跃迁方式是不同的，而且吸收光的波长范围不同，吸收光的几率也不同，从而可根据波长范围、吸光度鉴别不同物质结构方面的差异。紫外、可见吸收光谱分析法常称为紫外、可见分光光度法。

紫外、可见吸收光谱在生物材料研究中的应用主要用于研究分子中含有不饱和键（如羰基、羧基、酰胺基、双键、苯环等）的物质的性能，如物质的组成和结构分析、物质构型和构象的测定、单一物质、化合物和混合物组分含量的定量分析及其化合物相对分子质量的测定、材料的降解分析等，如利用紫外光谱跟踪分析生物可降解聚酯的羰基吸收峰的变化可反映这类生物材料的降解进程。

4．质谱

（1）质谱分析基本原理：质谱分析是通过对样品离子的质量和强度的测定来进行成分和结构分析的一种方法。在质谱图中每个质谱峰表示一种质荷比的离子，质谱峰的强度表示该离子峰的多少，因此根据质谱峰出现的位置可以进行定性分析，根据质谱峰的强度可以进行定量分析。

（2）质谱分析的应用：质谱是一种十分灵敏的分析方法，被广泛应用于研究材料的组成和结构，如聚合物的组成和结构鉴定、共聚物的组成和序列分布分析、高分子混合物的分析、聚合物中存在的微量单体和低分子量齐聚物以及各种添加剂的分析等，而且也可以作为聚合物初级热解机制研究的有力工具。此外，对于一些难溶、难熔的高分子的结构表征，裂解质谱（DYMS）是提供其结构信息惟一而有效的方法。如利用裂解质谱分析聚乳酸在360℃下的热降解性能时，裂解质谱上出现一系列强的准分子离子峰，这表明分子内交换反应形成环状齐聚物在聚乳酸的初级热分解过程中占优势。随着质谱技术的发展，各种解吸技术也用于获得高分子质谱，尤其是对生理高分子的序列分布分析特别有用。静态二次离子质谱（SSIMS）和快原子质谱（FABMS）对高分子的表面分析特别有用。

5．X线衍射　当一束平行的波长为λ＝0．05～0．25nm的X线射到晶体上时，使晶体内原子中的电子发生频率相同的强制振动，因此，可以把晶体中每个原子都看成是一个新的散射波源，它们各自向空间辐射与入射波相同频率的电磁波。由于这些散射波之间的干涉作用使得空间某些方向上的波始终保持互相叠加，于是在这个方向就可以观测到衍射线；而在另一些方向上的波始终是互相抵消的，于是就没有衍射线产生。所以，X线在晶体中的衍射现象，实质上是大量的原子散射波叠加的结果。衍射遵循Bragg公式

2dsinθ＝λ式中，d为晶面间距；θ为入射线与原子面间的交角；λ为X线波长。

X线衍射在生物材料研究中的应用主要是结晶性高分子材料和无机材料等的物相分析、结构鉴定、晶态与非晶态及晶型的确定以及结晶度、微晶尺寸和晶体的取向测定等，如通过X线衍射法研究聚左旋－乳酸（PL－LA）、羟基磷灰石（HA）、胶原、磷酸三钙（TCP）等物质的晶体组成和结构、晶型以及结晶度等。

二、分子量测定

组织工程研究中目前应用最多的支架材料主要是生物可降解高分子。作为支架材料使用，这类生物可降解高分子应具有良好的力学性能和加工性能，而材料的力学性能和加工性能以及其他性能与其分子量密切相关，因此，在应用材料之前，材料的分子量是需要考虑的一个重要指标。

低分子化合物一般有一固定分子量，而聚合物却是分子量不等的同系物的混合物，因此聚合物的分子量是一平均值，存在着分子量分布问题，即具有分子量多分散性。根据统计方法的不同，聚合物有不同的平均分子量，常用的有数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和黏均分子量（Mv）。Mw／Mn的比值称为聚合物的分子量分布指数。

测定聚合物分子量的方法有渗透压法、蒸汽压下降法、光散射法、黏度法和凝胶渗透色谱法等，其中，以黏度法和凝胶渗透色谱法的应用最为广泛。

黏度法测定的是聚合物的黏均分子量，具体方法是：选用一种合适的溶剂使聚合物完全溶解形成一定浓度的聚合物溶液，采用黏度计测定聚合物溶液在某一恒定温度下的特性黏数（［η］），根据下式Mark－Houwink方程计算得到聚合物的黏均分子量。

［η］＝KMva

式中，［η］为特性黏数；Mv为黏均分子量；K，a为与分子量无关的常数。

黏度法是测定聚合物分子量最简单的一种方法。在组织工程研究中，可采用黏度法来测定生物可降解高分子支架材料的特性黏数和黏均分子量以及降解过程中材料的特性黏数和黏均分子量的变化。黏度法的缺点是不能测定聚合物的分子量分布指数，因此，目前研究聚合物的分子量及分子量分布指数通常采用凝胶渗透色谱法。凝胶渗透色谱法（GPC）的应用范围非常广泛，如合成高分子和天然高分子、高分子和低分子、均聚物和共聚物的分子量及分子量分布指数的测定等。采用GPC法不仅可测定聚合物的分子量及分子量分布指数，而且可给出聚合物的组成、形态、构型等多方面的信息，现已成为研究聚合物的重要手段。如采用GPC法不仅可测定聚己内酯／聚乙二醇／聚乳酸（PCEL）三元共聚物在不同降解时间的分子量及分子量分布，而且从共聚物的GPC曲线随降解时间增加由较窄的对称单峰逐渐变为双峰还可说明共聚物的水解降解首先发生在材料的无定形区和结晶区的边缘。

三、溶 解 性 能

由于高聚物的分子量大且具有多分散性，分子的形状有线型支化和交联的不同，高分子的聚集态又有非晶态和晶态之分，因此高聚物的溶解过程比小分子物质的溶解要复杂得多。

线型高聚物的溶解过程分为两个阶段，首先是溶剂分子渗入高聚物内部，使高聚物体积膨胀，称为“溶胀”，然后才是高分子均匀分散在溶剂中，形成完全溶解的分子分散的均相体系。交联高聚物因有交联的化学键束缚，它们在溶剂中只发生溶胀不会溶解，如组织工程研究中应用较多的水凝胶因存在交联结构只能在水中溶胀，而不能溶解。

高聚物的溶解性能与多种因素有关，如分子量的大小、形状和聚集态等。一般随高聚物的分子量增大，高聚物的溶解性能下降；对交联高聚物而言，其溶胀度随交联度的增大而下降；晶态高聚物的溶解性能较非晶态高聚物的溶解性能差，如无定形的聚（D，L－乳酸）（PDL－LA）可溶于丙酮，而结晶性的聚（L－乳酸）（PL－LA）难以溶于丙酮，而易溶于极性较小的三氯甲烷。选择高聚物的溶剂时，通常遵循“相似相溶”和“极性相近”的原则。

四、密 度 测 定

在一定条件（温度、压力）下，物质的质量与其体积之比称之为质量密度，简称为密度（ρ），其定义式为：ρ＝m／V，单位为kg／m3。物质的密度与物质的本性有关。每种物质在一定温度、压力下其密度为常数，与该物质组成的系统形状、质量与体积无关。由于物质的绝对密度难以准确测量，因此，平时所指物质的密度一般是以4℃或20℃下的纯水作为参考物所得到的相对密度。

组织工程用生物材料一般为固体。固体物质密度的测量方法有多种，其中，密度瓶法比较容易，且精确度也较高，是应用较多的一种方法。密度瓶法的具体操作是：首先称出空密度瓶的质量（m0），再向瓶内注入已知密度（ρ）的辅助液体（该液体不溶解待测固体，但能润湿待测固体，一般采用水或乙醇），置于恒温槽中恒温一定时间。取出密度瓶擦干，再次称出密度瓶质量（m1），倒出液体，吹干密度瓶。将待测固体放入密度瓶内，恒温后称得质量为m2，然后向密度瓶内注入一定量辅助液体。将密度瓶放在真空干燥器内，抽气3～5min，使吸附在固体表面的空气全部抽走，再往瓶中注满辅助液体。将密度瓶放入恒温槽恒温，然后称得质量为m3，则固体的密度（ρs）可由下面的公式计算得到。

ρs＝（m2－m0）ρ／［（m1－m0）－（m3－m2）］

组织工程用多孔支架因具有大量相互连通的孔洞，所测得的密度往往称为表观密度。

五、力 学 分 析

在组织工程研究中，支架材料不仅为特定细胞提供附着场所，而且为细胞提供结构支撑作用，以抗击压力等外力，在体内维持组织形状和骨架完整性，因此，组织工程支架材料应具有一定的力学性质。支架材料的力学性质是决定其合理使用的一个重要因素。

生物材料的力学性质检测主要是研究材料的力学机械性质和生物高分子材料的黏弹性。试验方法有很多，如拉伸、压缩、剪切、弯曲、冲击、蠕变、应力松弛、滞后和力学损耗等。在介绍生物材料的力学性质检测之前，先简单介绍一下材料的这几种常用力学性质指标。

1．几种常见的力学性质指标

（1）拉伸强度：指在规定的试验温度、湿度和试验速度下，在标准试样上沿轴向施加拉伸载荷，直到试样被拉断为止，断裂前试样承受的最大载荷和试样的起始面积的比值。拉伸初始阶段的应力与应变的比值就称为拉伸模量（即杨氏模量）。

（2）压缩强度：是在规定试验条件下，向试样施加单向压缩载荷，试样所承受的最大载荷和试样的起始面积的比值。压缩初始阶段的应力与应变的比值则称为压缩模量。

（3）剪切强度：指在规定的试验条件下，向试样施加剪切力，直到试样的切向畸变达到最大为止，试验过程中的最大载荷与试样的起始截面积的比值。

（4）弯曲强度（亦称挠曲强度）：规定试验条件下，对标准试样施加静弯曲力矩，直到试样折断为止，取试验过程中的最大载荷P，按规定的公式分别计算得到弯曲强度和弯曲模量。

（5）冲击强度：通常指试样受冲击载荷而折断时单位截面积所吸收的能量。它是衡量材料韧性的一种强度指标，表征材料抵抗冲击载荷破坏的能力。

（6）蠕变和应力松弛：蠕变是指在一定温度和较小的恒定外力（拉力、压力或扭力等）作用下，材料的形变随时间的增加而逐渐增大的现象。应力松弛是指在恒定的温度和形变保持不变的情况下，聚合物材料内部的应力随时间增加而逐渐衰减的现象。应力松弛和蠕变统称为静态力学松弛过程或称静态黏弹性。

（7）滞后现象和力学损耗：高聚物材料在交变应力作用下，形变落后于应力变化的现象就称为滞后现象。滞后现象中，每一循环变化中所要消耗的功，就称为力学损耗，有时也称为内耗。在交变的应力、应变作用下发生的滞后现象和力学损耗统称为动态力学松弛，也称为高聚物的动态力学性质或动态黏弹性。

2．生物材料的力学性质检测　生物材料的力学机械性质的研究主要是测定材料的强度（如拉伸强度、压缩强度、弯曲强度、剪切强度和抗冲击强度）和模量（如拉伸模量、压缩模量和剪切模量）；测试的仪器主要有万能材料试验机、摆锤式冲击试验机和落球式冲击试验机等。如采用万能材料试验机研究组织工程多孔支架的抗压缩性能时，是在规定的试验温度、湿度和试验速度下，向试样施加单向压缩载荷，试样所承受的最大载荷和试样的起始面积的比值即为多孔支架的压缩强度；压缩初始阶段的应力与应变的比值则称为多孔支架的压缩模量。

生物高分子材料的黏弹性力学测试分静态和动态两种。静态力学测试是测定材料的蠕变和应力松弛行为；采用的仪器为蠕变仪和应力松弛仪。动态力学测试是测定材料的滞后现象和力学损耗；试验方法主要有自由衰减振动法（扭摆仪和扭辫仪）、强迫振动共振法（振簧仪）和强迫振动非共振法（动态黏弹谱仪）。由于聚合物由长链分子组成，分子运动具有明显的松弛特性，聚合物的力学性质对温度和时间的依赖性很强，表现为聚合物材料的黏弹性，因此，采用动态力学法来研究聚合物的力学性质是一种非常有效的测试方法。通过动态力学测试所测到的材料动态模量、损耗模量和力学损耗不仅可反映材料的宏观性质，如：疲劳寿命、韧性、冲击弹性、撕裂性能、耐热性、耐寒、耐老化等，而且还可反映出材料的微观结构变化和分子运动等方面的信息，如相对分子质量的大小、分子取向、聚合物的主转变和次级转变、结晶度大小、交联和共聚、共混等，以及温度、频率、时间、形变类型、气氛、湿度等环境变量的变化对聚合物材料动态性质的影响。例如医用聚氨酯弹性体是由软链段（聚醚、聚酯或聚烯烃长链）和硬链段（含有氨基甲酸酯基等强极性基团的链段）构成的嵌段共聚物，且具有微观相分离的聚集态结构，聚氨酯弹性体的性能与化学组成及相分离程度有密切关系，而聚合物的玻璃化转变、结晶、取向、相分离等结构变化都与分子运动状态的变化密切相关，因而可采用动态力学测试技术来研究聚氨酯弹性体聚集态结构、分子运动及部分物理性能等。

六、热　分　析

热分析（TA）是在程序控制温度下，测量材料物理性质与温度之间关系的一种技术。根据ICTA的归纳，现有的热分析技术方法可分为9类17种，其中，差热分析法（DTA）、差示扫描量热法（DSC）和热重分析法（TG）在生物材料研究中的应用最为广泛。

1．差热分析法　差热分析是在程序控温下测量试样与参比物之间的温差与温度关系的一类技术。差热分析法的主要优点是可用于测量样品在高温和高压下的热性质。一般DTA仪的工作温度可达1　500℃，超高温DTA仪的炉温可达2　400℃；且可用于几百大气压以上的研究工作。在生物材料领域研究中，利用DTA仪主要用于研究陶瓷（如HA、β－TCP和生物活性玻璃（BG））等无机生物材料的热性质，如根据物质的相变（包括熔融、升华和晶型转变等）和化学反应（包括脱水、分解和氧化还原等）所产生的特征吸收或放热峰对材料进行鉴别和成分分析等。也可利用DTA来研究生物高分子材料的玻璃化转变、相变和相图以及燃烧等。

2．差示扫描量热法（DSC）　DSC是在程序控温下测量输入样品和参比物的功率与温度关系的一类技术。记录的热谱图称为DSC曲线，其纵坐标是试样与参比物的功率差dT／dt，也称作热流率，单位为毫瓦（mW），横坐标为温度（T）或时间（t）。

DSC技术在生物材料研究中的应用：鉴于DSC能定量地量热、灵敏度高和工作温度可以很低，所以它的应用领域很宽，该技术特别适用于生物高分子材料领域的研究。尤其是在测定生物高分子材料的玻璃化转变温度、相变温度、分解温度、结晶度、混合物和共聚物的组成等方面，DSC是一种最佳的分析仪器。①非晶态生物高分子的研究：通过DSC可研究非晶态生物高分子的玻璃化温度转变、分子链的解缠结以及交联和降解反应。②结晶性生物高分子的研究：通过DSC可测定结晶性生物高分子的熔点（Tm）、平衡熔点（Tom）、熔融热焓和结晶度以及研究聚合物的双重、多重熔融行为和聚合物的结晶行为。③研究多组分生物高分子：采用DSC方法可测定多组分体系的组成以及研究多组分体系的相容性。如利用DSC测定高分子共混物的Tg是研究高分子共混物的相容性和相分离的一种十分简便有效的方法。对于不相容的高分子共混物，在它们的DSC曲线上将显示共混高分子各自的玻璃化温度转变，若在曲线上显示与共混组分的Tg不同的玻璃化转变温度，表明不同组分间相容性好。④测定生物高分子的热容：在升温速率不变时，DSC谱图中基线的偏移量只与试样和参比物的热容差有关。因此，可利用基线偏移量来测定某一聚合物的热容。⑤测定生物高分子的热导率。

3．热重分析法　热重分析法（TG）是在程序温度下测量试样的质量与温度或时间关系的一种方法，这里的程序温度包括升温、降温或某一温度下的恒温。热重法所用仪器称为热重分析仪或天平。热重分析仪的天平具有很高的灵敏度（可达到0．1μg）。由热重法记录的质量变化对温度的关系曲线称为热重曲线（TG曲线），它表示过程的失重累积量，属积分型，从热重曲线可得到试样组成、热稳定性、热分解温度、热分解产物和热分解动力学等有关数据。同时还可获得试样质量变化率与温度或时间的关系曲线，即微商热重曲线（DTG曲线）。微商热重分析主要用于研究不同温度下试样质量的变化速率，因此，它对确定分解的开始阶段温度和最大分解速率时的温度是特别有用的。

热重分析在生物材料研究中的应用：热重分析法主要用于研究在空气中或惰性气体中材料的热稳定性、热分解作用和氧化降解等化学变化；还广泛用于研究涉及质量变化的所有物理过程，如测定水分、挥发物和残渣、吸附、吸收和解吸、气化速度和气化热等；除此之外还可研究固相反应、缩聚聚合物的固化程度、有填料的聚合物或共混物的组成以及利用特征热谱图作鉴定等。