11．6．1 高浓度示差法
1．问题的引出
普通吸光光度法通常只适用于稀溶液的测定，当待测溶液浓度增加时，常有偏离朗伯－比尔定律的现象出现；即使不偏离朗伯－比尔定律，也因吸光度较大而超出合适的读数范围，引起较大的误差。为了减少误差，高浓度溶液的测定可先将溶液稀释，然后用普通吸光光度法测定，但更常用的方法是高浓度示差吸光光度法 （简称高浓度示差法或示差法）。
2．高浓度示差法的原理
高浓度示差法以浓度略低于试液的标准溶液作参比，测出试液的吸光度，这个吸光度是试液相对于作参比的标准溶液的相对吸光度 （记作Ar）；若试液与作参比的标准溶液的浓度差为Δc，则Ar与Δc之间的关系符合朗伯－比尔定律。
设试液的浓度为cx，标准溶液 （在示差法中作参比的标准溶液）的浓度为co（co略小于cx）。假如用普通光度法 （以溶剂或空白溶液作参比的光度法）测得试液与标准溶液的吸光度分别为Ax和Ao，按朗伯－比尔定律有：
Ax＝εbcx，Ao＝εbco
两式相减，有：
ΔA＝Ax－Ao＝εb（cx－co）＝εbΔc
当用上述标准溶液作参比时，示差法测得试液的吸光度为Ar，由于此时作参比的标准溶液的吸光度Ao为0，则Ar＝ΔA，因此：
Ar＝εbΔc
其中，Ar是试液相对于作参比的标准溶液的相对吸光度；Δc＝cx－co是试液与作差比的标准溶液的浓度差。此式是朗伯－比尔定律在高浓度示差法中的特殊形式，也是高浓度示差法定量分析的依据。
3．定量方法
以标准曲线法为例，高浓度示差法的定量方法为：以浓度为co的标准溶液作参比，测得一系列 （n个）已知浓度为cs，i（i＝1，…，n）（cs，i均略大于co）的标准溶液的相对吸光度为Ar，i，Ar，i与Δci＝cs，i－co之间的关系符合式Ar＝εbΔc，以Ar，i对Δci作图，得标准曲线。仍以浓度为co的标准溶液作参比，测得浓度为cx的试液的相对吸光度为Ar，Ar与Δc＝cx－co之间的关系同样符合Ar＝εbΔc，根据Ar可从标准曲线查得试液与作参比的标准溶液的浓度差Δc，按cx＝co＋Δc可求出试液的浓度cx。
4．高浓度示差法可以减少误差的原因
普通吸光光度法直接测出的是试液的绝对浓度cx。该法以溶剂或空白溶液作参比，当试液浓度cx较高时，测得的吸光度比较大，超出了合适的吸光度读数范围，由吸光度的读数误差引起的浓度cx的误差是比较大的。
高浓度示差法直接测出的不是试液的绝对浓度cx，而是试液与作参比的标准溶液的浓度差Δc。该法以浓度略低于试液的标准溶液作参比，当试液浓度cx较高时，试液与作参比的标准溶液的浓度差Δc却是比较小的，测得的吸光度也比较小，可以在合适的吸光度读数范围内，由吸光度的读数误差引起的试液与作参比的标准溶液的浓度差Δc的误差也比较小。此外，在高浓度示差法中，作参比的标准溶液的浓度co是准确已知的，因此按cx＝co＋Δc求出的试液浓度cx的误差便比较小。
高浓度示差法以浓度略低于试液的标准溶液作参比，不仅减少了由吸光度读数误差引起的试液浓度的误差，同时也消除了反射和其他吸收的影响。这种方法相当于在扣除了作参比的标准溶液的浓度及反射和其他吸收的基础上，测定试液与作参比的标准溶液的浓度差。
11．6．2 光度滴定法
测定滴定过程中的溶液的吸光度，以吸光度对加入的标准溶液体积作图，得到所谓的光度滴定曲线，根据光度滴定曲线确定滴定终点的方法称为光度滴定法。
如用EDTA滴定Cu2＋，发生滴定反应：
Cu2＋＋Y4－＝Cu Y2－
其中，Cu2＋与Y4－均不吸收波长为745 nm的光，只有Cu Y2－吸收该波长的光。随着EDTA的加入，Cu2＋与Y4－生成Cu Y2－，溶液的吸光度增大；Cu2＋反应完全后，随着EDTA的加入，溶液的吸光度不再变化 （严格地说，随着EDTA的加入，溶液被稀释，吸光度略有减小）。上述过程的滴定曲线如图11－10所示，图中转折点对应的横坐标便是滴定Cu2＋用去的EDTA标准溶液的体积。
图11－10 光度滴定曲线示意图
11．6．3 多组分同时测定
1．吸收曲线不重叠
若两种或两种以上组分的吸收曲线不重叠，或每种组分至少可以找到一个波长，在这个波长下，该组分的吸光度比较大而其他组分不吸光，则可在不同波长下对每种组分分别进行测定，其他组分不会产生干扰。这种情况与单组分的测定是相同的。
2．吸收曲线重叠
若两种或两种以上组分的吸收曲线彼此重叠，根据吸光度的加和性，可对多种组分进行同时测定。下面以两种组分的同时测定为例，说明其原理。
设试液中存在两种组分x和y，这两种组分的吸收曲线如图11－11所示，找出两个吸收波长λ1和λ2，在这两个波长处，分别测吸光度：
λ1处： A1＝εx1bcx＋εy1bcy
λ2处： A2＝εx2bcx＋εy2bcy
上述A1和A2是波长λ1和λ2处测得的吸光度；cx和cy是组分x和y的浓度；εx1和εy1是组分x和y在波长λ1处的摩尔吸光系数；εx2和εy2是组分x和y在波长λ2处的摩尔吸光系数。其中，εx1和εx2可用只含x的标准溶液分别在波长λ1和λ2处测得；εy1和εy2可用只含y的标准溶液分别在波长λ1和λ2处测得。这样便得到了含cx和cy两个待求参数的联立方程。解出此联立方程，可求出cx和cy。
图11－11 多组分同时测定示意图
为了减少误差，在实际测定时，通常在大于两个波长处测得吸光度，得到含cx和cy两个待求参数的由大于两个方程构成的所谓超定方程组，用线性最小二乘法或其他数学方法可求出cx和cy。
采用与上述相同的方法，原则上也可同时测定三种或三种以上的组分，但误差一般比较大。
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