高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。它具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点。典型高效液相色谱法的流程如图13－5所示。
图13－5 高效液相色谱流程示意图
1．高压输液泵 2．混合器 3．进样器 4．色谱柱 5．检测器 6．计算机
与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：应用了颗粒极细 （一般为10μm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；采用高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快，一般试样的分析需几分钟，复杂试样分析在几十分钟内即可完成；广泛使用了高灵敏度检测器，大大提高了灵敏度。紫外检测器的最小检测限可达10－9g，而荧光检测器的最小检测限可达10－12g。
与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
高效液相色谱法已广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定，尤其在生物样品、中药等复杂体系的成分分离分析中发挥着极其重要的作用。随着与质谱、核磁共振波谱等联用技术的发展，高效液相色谱法的应用将愈加广泛。
13．3．1 高效液相色谱法的主要类型及其固定相和流动相
1．高效液相色谱法的主要类型
近年来，高效液相色谱法的发展非常迅猛，在经典液相色谱各类方法的基础上，又有许多新方法不断涌现和完善。但高效液相色谱法的主要类型与经典液相色谱法相似。按固定相的聚集状态，高效液相色谱法包括液液色谱法 （Liquid Liquid Chromatography， LLC）和液固色谱法 （Liquid Solid Chromatography，LSC）两大类。按分离机制则包括分配色谱法 （Partition Chromatography）、吸附色谱法 （Adsorption Chromatography）、离子交换色谱法 （Ion Exchange Chromatography，IEC）和分子排阻色谱法 （Molecular Exclusion Chromatography，MEC）四类基本类型。除此之外，高效液相色谱法还包括许多与分离机制有关的色谱类型，如亲和色谱法 （Affinity Chromatography，AC）、手性色谱法 （Chiral Chromatography，CC）、胶束色谱法 （Micellar Chromatography，MC）、电色谱法 （Electro Chromatography，EC）和生物色谱法 （Bio Chromatography，BC）等。目前高效液相色谱法中最常用的固定相是化学键合相，故又将这些方法称为化学键合相色谱法。本章主要讨论常见化学键合相色谱法以及由其衍变和发展而来的离子抑制色谱法（Ion Suppression Chromatography，ISC）和离子对色谱法 （Paired Ion Chromatography， PIC或Ion Pair Chromatography，IPC），并简单介绍其他几种液相色谱方法。
2．高效液相色谱法的固定相
不同类型的高效液相色谱法所用固定相各不相同，但所有固定相都应满足：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。传统液液分配色谱法的固定相是涂在细颗粒载体表面的液体，但这些在HPLC中已几乎不用了。HPLC中液固吸附色谱法的固定相主要是全多孔型硅胶和高分子多孔微球。HPLC中应用最多的是化学键合相，下面进行重点讨论。
化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相，简称键合相（bonded phase）。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法 （Bonded Phase Chromatography，BPC）。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，适用于分离几乎所有类型的化合物，是应用最广的色谱法。
（1）常用化学键合相的种类和性质
常用化学键合相的种类很多，键合型离子交换剂、手性固定相及亲和色谱固定相等都属于化学键合相，但是最常用的是反相和正相键合相色谱法中的化学键合相。按照所键合基团的极性可将其分为非极性、弱极性和极性三类。
①非极性键合相。这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基等。十八烷基硅烷 （octadecyl silane，ODS或C18）键合相是最常用的非极性键合相。
非极性键合相的烷基长链对溶质的保留、选择性和载样量都有影响。长链烷基可使溶质的k增大，分离选择性改善，使载样量提高，长链烷基键合相的稳定性也更好。因此十八烷基键合相 （ODS）是HPLC中应用最为广泛的固定相。短链非极性键合相的分离速度较快，对于极性化合物，可得到对称性较好的色谱峰，苯基键合相和短链的键合相有些相似。非极性键合相通常用于反相色谱。
②弱极性键合相。常见的有醚基和二羟基键合相。这种键合相可作为正相或反相色谱的固定相，具体视流动相的极性而定。目前这类固定相的应用较少。
③极性键合相。常用氨基、氰基键合相，它们是分别将氨丙硅烷基（≡Si（CH2）3NH2）及氰乙硅烷基 （≡Si（CH2）2CN）键合在硅胶上制成，一般都用作正相色谱的固定相，但有时也用于反相色谱。
氰基键合相是质子接受体，其分离选择性与硅胶相似，与双键化合物可能发生选择性作用，因而对双键异构体或含双键数不同的环状化合物有较好的分离能力。一些在硅胶上不能分离的极性较强的化合物也可在氰基键合相上分离。
氨基键合相与酸性硅胶具有不同的性能，兼有氢键接受和给予两种性能。氨基键合相上的氨基可与糖分子中的羟基选择性作用，因此在糖的分离中被广泛使用。在酸性介质中它还是一种弱阴离子交换剂，能分离核苷酸。值得注意的是，氨基键合相不宜分离带羰基的物质，如甾酮、还原糖等；流动相中也不得含有羰基化合物，这是因为氨基可与醛或酮反应。
（2）键合相的性质和特点
①键合反应。目前使用的化学键合相主要为硅氧烷 （Si—O—Si—C）型键合相，是以氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应而制得。ODS是以十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基反应键合而成，反应式如下：
如果试剂中一个R或两个R均为Cl，则还可与另一个硅醇基反应生成硅氧烷键。
一般键合相代号的前部代表载体，后部为键合基团，如国产YWG－C18H37为无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；又如Waters公司的Spherisorb ODS为球形硅胶Spher－isorb上键合了ODS。
近年来，除了键合基团的改变外，硅胶载体也进行了许多改进，如出现了在硅胶基质内键合了桥式乙烷的硅－碳杂化硅胶，以此为载体的键合相机械强度有显著提高，能耐更高的p H，柱效更高。
②含碳量和覆盖度。键合相表面基团的键合量，可通过对键合硅胶进行元素分析，用含碳的百分数表示。例如十八烷基键合相的含碳量可以在5％～40％的范围。基团的键合量也可用表面覆盖度来表示，即参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。由于键合基团的空间位阻效应，使硅醇基不能全部参加键合反应，因此残余硅醇基是不可避免的。残余硅醇基对键合相特别是非极性固定相的性能影响很大，它可以减弱键合相表面的疏水性，对极性溶质产生次级化学吸附，使保留机制复杂化。而且覆盖度的变化又是影响键合相产品性能重复性的重要因素。为减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，即封尾 （end－capping）。封尾后的ODS吸附性能降低，稳定性增加。
③键合相的特点。键合相有如下优点：化学稳定性好，使用过程中不流失，柱寿命长；均一性和重现性好；柱效高，分离选择性好；适于梯度洗脱；载样量大。
应该注意的是：使用硅胶基质的化学键合相时，流动相中水相的p H应维持在2～8，否则会引起硅胶溶解，以硅－碳杂化硅胶等为基质的键合相可用于很宽的p H范围 （如p H＝2～12）；不同厂家、不同批号的同一类型键合相也可能表现出不同的色谱特性。
（3）其他种类的固定相
①键合型离子交换剂 （ion exchanger）。以硅胶为载体的键合型离子交换剂是在全多孔 （或薄壳型）硅胶的表面，用化学方法键合上各种离子交换基团。这类离子交换剂具有耐压、化学和热稳定性好、分离效率高等优点，但其交换容量比离子交换树脂小，而且不宜在p H＞9的流动相中使用。常用的阳离子型键合相是强酸性磺酸型 （—SO3H），如国产YWG－SO3H和进口Hypersil SAX等；常用阴离子型键合相是季胺盐型 （—NR3Cl），如YWG－R3NCl和Hypersil SCX等。此外，还有弱酸 （碱）型离子交换剂，它们的离子交换基团的离解在p H＝4～8之间受p H的影响很大。而强酸 （碱）型离子交换剂的交换基团在很宽的p H范围内均能完全离解。
②手性固定相 （Chiral Stationary Phase，CSP）。用于HPLC的手性固定相很多，根据键合的手性选择物的结构特征和手性分离机制，可以分类为蛋白类CSP、多糖CSP、环糊精CSP、π－氢键型CSP、大环抗生素类CSP、配体交换CSP以及其他类型CSP。
蛋白类CSP有键合的有α1－酸性糖蛋白 （α1－acid glycoprotein，AGP）、清蛋白和卵类蛋白。蛋白质的一级结构中有数百个手性中心，加上其二级螺旋和三级结构，使其具有很强的手性识别能力，可拆分酸、碱或非离子型化合物的对映体；可通过改变流动相的p H、有机调节剂的类型和含量、离子强度等来改善分离。但其载样量小、稳定性差且价格昂贵。π－氢键型CSP又称刷型CSP，是一种合成手性固定相。其中最常见的Pirkle型是以苯甘氨酸或亮氨酸的3，5－二硝基苯甲酰衍生物等有光学活性的有机小分子键合在氨丙基硅胶上而制得。这类键合相的典型结构如下：
③亲和色谱固定相。由载体和键合在其上的配基 （Ligand）组成，为了避免载体的立体障碍，使溶质能更好地接近配基，在配基和载体之间还有一个适当长度的间隔臂（spacer arm）。高效亲和色谱 （High Performance Affinity Chromatography，HPAC）固定相的载体是小粒径的刚性或半刚性的惰性物质，多孔硅胶是使用最广的刚性载体，载体还有苯乙烯－二乙烯基苯的聚合物全多孔微球等。配基可分为生物特效性配基和基团配基两大类。有生物专一性作用的体系，如抗体－抗原、酶－底物、激素－受体等的任何一方都可键合在载体上，作为分离另一方的配基，如胞嘧啶核苷酸 （Cytidine Monophos Phate，CMP）键合在氨丙基硅胶上组成的固定相可用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶等多种蛋白质的纯度分析。其结构如下：
3．高效液相色谱法的流动相
HPLC对流动相的基本要求：化学稳定性好，不与固定相发生化学反应；对试样有适宜的溶解度。要求使k在1～10范围内，最好在2～5的范围内；必须与检测器相适应，例如用紫外检测器时，只能选用截止波长小于检测波长的溶剂；纯度要高，黏度要低。低黏度流动相如甲醇、乙腈等可以降低柱压，提高柱效。
流动相使用之前，需用微孔滤膜滤过，除去固体颗粒，并且还要进行脱气。
（1）流动相对分离的影响
用分离方程式可以讨论各种因素对GC分离的影响。现在，同样可用该方程式讨论HPLC中流动相对分离的影响。分离方程式为：
在HPLC中，n由固定相及色谱柱填充质量决定，α主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。因为不同种类的溶剂，其分子间的作用力不同，所以有可能使被分离的两个组分的分配系数不等，即α≠1。改变流动相中各种溶剂的配比，能改变其洗脱能力，组分的k也改变。增加流动相中强溶剂的比例，其洗脱能力增强，使k变小。下面讨论键合相色谱中溶剂的强度和选择性。
（2）溶剂的强度和选择性
①溶剂的极性和强度。在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力即溶剂强度，直接与它的极性相关。在正相键合相色谱中，由于固定相是极性的，所以溶剂极性越强，洗脱能力也越强，即极性强的溶剂是强溶剂；在反相键合相色谱中，由于固定相是非极性的，所以溶剂的强度随溶剂极性的降低而增加，即极性弱的溶剂洗脱能力强。例如，已知水的极性比甲醇的极性强，所以在以ODS为固定相的反相色谱中，甲醇的洗脱能力比水强。描述溶剂极性的方法有数种，最实用的是斯奈德 （Snyder）提出的溶剂极性参数 （polari－ty parameter of solvent），它是根据罗胥那德 （Rohrschneider）的溶解度数据推导出来的，因此可度量分配色谱的溶剂强度。它表示溶剂与三种极性物质乙醇 （质子给予体）、二氧六环 （质子受体）和硝基甲烷 （强偶极体）相互作用的度量。将罗氏提供的极性分配系数K″g以对数的形式表示，纯溶剂的极性参数 （P′）定义为：
P′＝lg（K″g）e＋lg（K″g）d＋lg（K″g）n
常用溶剂P′见表13－7。P′值越大，则溶剂的极性越强，在正相键合相色谱中的洗脱能力越强。
表13－7 常用溶剂的极性参数P′和选择性参数
反相键合相色谱法的溶剂强度常用另一个强度因子S表示。常用溶剂的S值列于表13－8，比较表13－8与表13－7的数据和顺序可见，在正、反相键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力大体上相反。例如，在正相洗脱时，水的洗脱能力最强 （P′最大，为10．2）；而在反相洗脱时，水的洗脱能力最弱 （S最小，为0）。
表13－8 反相键合相色谱法常用溶剂的强度因子 （S）
②混合溶剂的强度。用于正相键合相色谱法的多元混合溶剂的强度，用极性参数P′混来表示，其值为各组成溶剂极性参数的加权和：
式中，P′i和φi为纯溶剂i的极性参数及该溶剂在混合溶剂中的体积分数。
反相色谱法的混合溶剂的强度因子用类似方法计算：
③溶剂的选择性。斯奈德以溶剂和溶质间的作用力作为溶剂选择性分类的依据，将选择性参数定义为：
其中，Xe，Xd，Xn分别反映溶剂的质子接受能力、质子给予能力和偶极作用力。根据Xe，Xd，Xn（见表13－7）的相似性，将常用溶剂分为八组 （见表13－9），并得到溶剂选择性分类三角形 （图13－6）。
表13－9 部分溶剂的选择性分组
图13－6 溶剂选择性分类三角形
由图13－6可见，Ⅰ组溶剂Xe值较大，属于质子接受体溶剂；Ⅴ组溶剂Xn最大，属偶极中性化合物；Ⅷ组溶剂的Xd值较大。处于同一组中的各溶剂，作用力类型相同，在色谱分离中具有相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性差别较大。采用不同组别的溶剂为流动相，能够改变色谱分离的选择性。
4．正相键合相色谱法
与液液分配色谱法类似，根据化学键合相与流动相极性的相对强弱，键合相色谱法可分为正相 （Normal Phase，NP）和反相 （Reversed Phase，RP）键合相色谱法。至今对键合相色谱的选择性相互作用的本质的认识尚不统一，对保留机制的解释也存在争议。以下重点阐述溶质的保留规律。
正相键合相色谱法 （normal bonded phase chromatography）采用极性键合相为固定相，如氰基 （—CN）、氨基 （—NH2）或二羟基等键合在硅胶表面。以非极性或弱极性溶剂，如烷烃加适量极性调整剂如醇类作流动相。氰基键合相的分离选择性与硅胶相似，但其极性比硅胶弱，即流动相及其他条件相同时，同一组分在氰基柱上的保留比在硅胶柱上的保留弱。许多需要用硅胶的分离，可用氰基键合相完成。
正相键合相色谱法主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。正相键合相色谱法的分离机制有各种不同的解释，通常认为其属于分配过程，把有机键合层作为一个液膜看待，组分在两相间进行分配，极性强的组分的分配系数K大，t R也大。也有人认为是它吸附过程，即溶质的保留主要是它与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用的结果。例如，用氨基键合相分离可形成氢键的极性化合物时，主要靠被分离组分与键合相的氢键作用强弱的差别而实现分离；若分离含有芳环等可诱导极化的弱极性化合物时，则键合相与组分间的作用主要是诱导作用。
正相键合相色谱法的分离选择性决定于键合相的种类、流动相的强度和试样的性质。总的说来，在正相键合相色谱中，组分的保留和分离的一般规律是：极性强的组分，保留因子k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，t R减小；反之，k增大，t R增大。
5．反相键合相色谱法
反相键合相色谱法 （reverse bonded phase chromatography）采用非极性键合相为固定相，如十八烷基硅烷 （C18）、辛烷基 （C8）等化学键合相，有时也用弱极性或中等极性的键合相为固定相。流动相以水作为基础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，常用甲醇－水、乙腈－水等。总之，固定相的极性比流动相的极性弱。
长期以来，对反相键合相色谱法的分离机制一直没有一致的看法，存在吸附与分配的争论，而后又有疏溶剂理论、双保留机制、顶替吸附－液相相互作用模型等。下面介绍反相键合相色谱中影响溶质保留行为的主要因素。
（1）溶质的分子结构
溶质的极性越弱，其与非极性固定相的相互作用越强，k越大，t R也越大。在同系物中，含碳数越多，则极性越弱，k越大。引入极性基团，则增强溶质分子的极性，k变小。如2，4－二硝基苯酚在反相键合相色谱中比苯酚先洗脱出柱；反之，引入非极性基团，使溶质分子与非极性固定相的相互作用也增强，则使k值增大。
（2）流动相
在反相键合相色谱中，流动相的极性对溶质的保留有很大影响。水的极性最强，因此当溶质和固定相不变时，若增加流动相中水的含量，则溶剂强度降低，使溶质的k变大。实验表明，k的对数值与流动相中的有机溶剂的含量通常是线性关系，有机溶剂含量增加，k变小。
流动相的p H变化会改变溶质的离解程度，当其他条件不变时，溶质的离解程度越高，k越小。因此，常加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液来调节流动相的p H，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的作用，以达到分离的目的。这种色谱方法又称为离子抑制色谱法。
离子抑制色谱法适用于分析3≤p Ka≤7的弱酸及7≤p Ka≤8的弱碱。一般来说，对于弱酸，降低流动相的p H，使k增大，t R增大；对于弱碱，则需提高流动相的p H，才能使k变大，t R增大。若p H控制不合适，溶质以离子态和分子态共存，则可能使峰变宽和拖尾。此外，还要注意流动相的p H不能超过键合相的允许范围。
（3）固定相
键合烷基的极性随碳链的延长而减弱，因此与非极性溶质的相互作用增强，溶质的k也增大。当链长一定时，硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。此外，键合基团的链长和浓度还影响分离的选择性。
反相键合相色谱法是应用最广的色谱法，适合分离非极性至中等极性的组分，由其派生的离子抑制色谱法和反相离子对色谱法，还可以分离有机酸、碱及盐等离子型化合物。据统计，反相键合相色谱法几乎可以解决80％的液相色谱分离问题。
6．反相离子对色谱法
离子对色谱法可分正相与反相离子对色谱法，因为前者已少用，故只介绍反相离子对色谱法。
反相离子对色谱法 （Reversed Phase Ion－pair Chromatography，RPIC）是把离子对试剂加入到含水的流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子 （或称对离子，counter ion）生成不带荷电的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。用于分离可离子化或离子型的化合物。
（1）离子对模型
对于反相离子对色谱法的保留机制，已提出的理论模型有离子对模型、动态离子交换模型和离子相互作用模型等。下面用离子对模型来说明反相离子对色谱法的保留机制。
离子对模型认为，试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子生成不带荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生保留。以有机碱 （B）为例。调节流动相的p H，使碱转变成正离子BH＋形式，BH＋与流动相中离子对试剂 （烷基磺酸盐）的反离子RSO3－生成不带荷电的离子对，此中性离子对在固定相和流动相间达成分配平衡。以下式表示此方程为：
以通式表示为：
式中，B＋表示溶质离子，A－表示离子对试剂反离子，下标m代表流动相，下标s代表固定相。形成的中性离子对与非极性固定相的作用较强，使分配系数增大，保留作用增强，从而改善分离效果。
按照上述模型，溶质离子B＋在固定相和流动相间的分配系数为：
式中，EBA为萃取常数。EBA的大小与溶质离子B＋和离子对试剂的反离子的性质、固定相的性质及温度有关。
（2）影响保留因子的因素
在反相离子对色谱中，溶质的分配系数决定于固定相、离子对试剂及其浓度、流动相的p H、溶质的性质和温度。
①离子对试剂的种类和浓度。分析酸类或带负电荷的物质时，一般用季胺盐作离子对试剂，常用的有四丁基季胺盐，如四丁基铵磷酸盐 （TBA）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等；分析碱类或带正电荷的物质时，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐作离子对试剂，如正戊烷基磺酸钠 （PICB5）、正己烷基磺酸钠 （PICB6）、正庚烷基磺酸钠 （PICB7）等。在反相离子对色谱中，离子对试剂的碳链长度增加，溶质的k就相应增大。
从上式可以看出，溶质的分配系数随离子对试剂的浓度升高而增大。但实验发现，只有在离子对试剂浓度较低时，溶质的k随离子对试剂的浓度升高而增大，然后趋于恒定（图13－7）。如果采用长链离子对试剂如正癸烷磺酸盐，当离子对试剂浓度超过一定值时，k反而减小，这种溶质的k出现极大值的现象是离子对试剂形成胶束的结果。
图13－7 离子对试剂浓度对溶质保留因子的影响
②流动相的p H。由于离子对的形成依赖于试样组分的离解程度，而当试样组分与离子对试剂全部离子化时，最有利于离子对的形成，组分的k值最大。因此，流动相的p H对弱酸、弱碱的保留有很大影响，而对强酸、强碱的影响很小。
由此可见，只要改变流动相的p H、离子对试剂的种类和浓度，就可改变组分的k值和分离的选择性。
离子对色谱法适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。在药物分析中，离子对色谱法的应用非常广泛，如生物碱类、儿茶酚胺类、有机酸类、维生素类和抗生素类药物均可用此法进行分析。
7．其他高效液相色谱法
（1）手性色谱法
手性色谱法是利用手性固定相 （Chiral Stationary Phase，CSP）或手性流动相添加剂（Chiral Mobile Phase Additive，CMPA）分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。此外，还有间接法分析手性化合物的对映体，即将试样与适当的手性试剂 （单一对映体）反应，使一对对映异构体转变为非对映异构体，然后用常规HPLC法分离分析。
实现手性拆分的基本原理是对映异构体与手性选择剂 （固定相或流动相添加剂）形成瞬间非对映立体异构 “配合物”，由于两对映异构体形成的 “配合物”的稳定性不同，因而实现分离。手性固定相的种类很多，它们与对映体的作用力也各不相同。如π－氢键型固定相与手性化合物之间一般认为有三种作用力，即π－π相互作用、氢键作用和偶极间相互作用，化合物与固定相之间的作用部位至少有一个受对映体立体构型的影响。环糊精（Cyclodextrin，CD）也是一种手性选择剂，CD手性固定相的手性分离机制有多种解释，但均认为主要是由于其分子内疏水空腔的大小和多手性中心的作用，如果对映体能被空腔紧密包络，而且与CD分子外沿的仲醇基作用，则被固定相保留。如果两对映体与CD的作用程度不等，则产生对映体选择性分离。
（2）亲和色谱法
亲和色谱法 （Affinity Chromatography，AC）是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂试样中分离和分析能产生专一性亲和作用的物质的一种色谱方法。许多生物分子之间都具有专一的亲和特性，如抗体与抗原、酶与底物、激素或药物与受体、RNA与和它互补的DNA等。将其中之一 （如酶、抗原）固定在载体上，构成固定相，则可用于分离纯化与其有专一性亲和作用的物质 （如该酶的底物、抗体）。
亲和色谱是基于试样中的组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的。如图13－8所示，当含有亲和物的试样流经固定相时，亲和物就与配基结合形成亲和复合物，被保留在固定相上，而其他组分则直接流出色谱柱，然后改变流动相的p H或组成，以减弱亲和物与配基的结合力，将亲和物以很高的纯度洗脱下来。亲和色谱法是各种分离模式的色谱法中选择性最高的方法，其回收率和纯化效率都很高，是生物大分子分离和分析的重要手段。
图13－8 亲和色谱示意图
1．亲和物 2．其他组分 3．配基 4．亲和复合物 5．间隔臂
13．3．2 高效液相色谱法分离条件的选择
1．高效液相色谱中的速率理论
（1）涡流扩散 （eddy diffusion）
与气相色谱相同，涡流扩散项也是A＝2λd P，为了降低涡流扩散的影响，HPLC中一般使用3～10μm的小颗粒固定相，目前有2μm以下的固定相。为了填充均匀，减小填充不规则因子，常采用球形固定相，而且要求粒度均匀 （RSD＜5％）。此外，HPLC色谱柱以匀浆高压填充。
（2）纵向扩散 （longitudinal diffusion）
纵向扩散系数B＝2λDm，而Dm与流动相的黏度（η）成反比，与温度成正比。在HPLC中，流动相是液体，其黏度比气体大得多 （约102倍），而且常在室温下进行操作，因此组分在流动相中的扩散系数Dm比气相色谱的要小得多 （为10－5倍左右）。而且HPLC的流速一般都在最佳流速以上，这时纵向扩散项很小，可以忽略。
（3）传质阻抗
①固定相传质阻抗 （stationary phase mass transfer resistance）：在化学键合相色谱法中，键合相多为单分子层，即厚度df可忽略，因此固定相传质阻抗Cs可以忽略。
②流动相传质阻抗 （mobile phase mass transfer resistance）：在HPLC中存在流动相传质阻抗Cm。这是由于在流路中心的流动相中的组分分子还未来得及扩散进入流动相和固定相界面，就被流动相带走，因此总是比靠近填料颗粒与固定相达到分配平衡的分子移动得快些，结果使峰展宽。这种传质阻力与固定相颗粒粒度dp的平方成正比，与组分分子在流动相中的扩散系数成反比，即：
式中，ωm是由色谱柱及其填充情况决定的因子。
③静态流动相传质阻抗 （static mobile phase mass transfer resistance）：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，再与固定相进行分配，因而相对较晚回到流路中，引起峰展宽。如果固定相的微孔多，且又深又小，传质阻抗就大，峰展宽就严重。HPLC中静态流动相传质阻抗系数Csm也与固定相粒度dp的平方成正比，与分子在流动相中的扩散系数成反比。
由此可知，为了降低流动相传质阻抗，也需要使用细颗粒的固定相。又由于组分在流动相中的扩散系数Dm与流动相的黏度（η）成反比，与温度（T）成正比，为了提高柱效，需要选用低黏度的流动相。在实践中常使用低黏度的甲醇（η＝0．54m Pa·s）或乙腈（η＝0．34m Pa·s），而很少用乙醇（η＝1．08m Pa·s）。
值得注意的是，两种黏度不同的溶剂混合时，其黏度变化不呈线性。例如，水与甲醇混合时，40％甲醇黏度最大，达1．84m Pa·s，进行梯度洗脱时，这种变化不仅会影响柱压，还会影响柱效。
综上所述，HPLC中的范第姆特方程为：
H＝A＋Cmu＋Csmu
由上式可见，流动相流速提高，色谱柱柱效降低 （但变化不如在GC中快），因此高效液相色谱流动相的流速也不宜过快，分析型HPLC一般流量为1m L／min左右。
（4）固定相颗粒粒度对塔板高度的影响
由于A，Cm和Cs m均随固定相颗粒粒度dp的变小而变小，而且实验还表明固定相颗粒粒度越小，柱效受流动相线速度的影响也越小 （图13－9）。可见小的dp是保证HPLC高柱效的主要措施，近年来许多商品固定相的颗粒粒度已小于2μm。
根据速率理论，HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低黏度流动相，流速不宜快；③柱温适当。
图13－9 HPLC固定相颗粒粒度和流动相线速度对柱效的影响
2．分离条件的选择
（1）正相键合相色谱法的分离条件。
正相键合相色谱法一般以极性键合相为固定相，如氰基、氨基键合相等。分离含双键的化合物常用氰基键合相，分离多基团化合物如甾体、强心苷以及糖类等常用氨基键合相。
正相键合相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调节剂，极性调节剂常从Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ组 （表13－9）中选。例如，以正己烷作为基础溶剂，与异丙醚 （Ⅰ）组成的二元流动相，通过调节极性调节剂异丙醚的浓度来改变溶剂强度P′，使试样组分的k值在1～10范围内。若溶剂的选择性不好，可以改用其他组别的强溶剂如三氯甲烷 （Ⅷ）或二氯甲烷 （Ⅴ），与正己烷组成具有相似P′值的二元流动相，以改善分离的选择性。若仍难以达到所需要的分离选择性，还可以使用三元或四元溶剂系统。
（2）反相键合相色谱法的分离条件
在反相键合相色谱法中，常选用非极性键合相，非极性键合相可用于分离分子型化合物，也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS是应用最广泛的非极性固定相。对于各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物如黄酮苷类等。
反相键合相色谱法中，流动相一般以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂。极性调节剂的性质以及其与水的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇－水已能满足多数试样的分离要求，且黏度小、价格低，是反相键合相色谱法最常用的流动相。乙腈的溶剂强度较高，且黏度较小，其截止波长（190nm）比甲醇 （205nm）的短，更适合于利用末端吸收进行检测。
可选择弱酸 （常用醋酸）、弱碱 （常用氨水）或缓冲盐 （常用磷酸盐及醋酸盐）作为抑制剂，调节流动相的p H，抑制组分的离解，增强保留。但p H需在固定相所允许的范围内，以免损坏键合相。
调节流动相的离子强度也能改善分离效果，在流动相中加入0．1％～1％的醋酸盐、磷酸盐等，可减弱固定相表面残余硅醇基的干扰作用，减少峰的拖尾，改善分离效果。
（3）反相离子对色谱法的分离条件
反相离子对色谱法 （Reversed Phase Ion－pair Chromatography，RPIC）要求尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的键合相，如C18或C8键合相。短链烷基键合相的稳定性较差而不宜采用。
在反相离子对色谱法中，影响试样组分的保留值和分离选择性的主要因素有离子对试剂的性质和浓度、流动相的p H以及流动相中所含有机溶剂的种类和比例等。
①离子对试剂的选择：离子对试剂 （ion pair reagent）所带的电荷应与试样离子的电荷相反。分析酸类或带负电荷的物质时，常用季胺盐作离子对试剂；分析碱类或带正电荷的物质时，常用烷基磺酸盐 （或硫酸盐）作离子对试剂。离子对试剂的选择见表13－10。离子对试剂的浓度一般在3～10mmol／L。
②流动相p H的选择：调节p H使试样组分与离子对试剂全部离子化，将有利于离子对的形成，并改善弱酸或弱碱试样的保留值和分离选择性。各种离子对色谱法的适宜p H范围也列于表13－10。
表13－10 反离子对色谱中离子对试剂和p H的选择
③有机溶剂及其浓度的选择：与一般反相HPLC相同，流动相中所含有机溶剂的比例越高，组分的K值越小。被测组分或离子对试剂的疏水性越强，需要有机溶剂的比例越高。
13．3．3 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪主要包括输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统和数据记录处理系统。其中输液系统主要为高压输液泵，有的仪器还有在线脱气和梯度洗脱装置。进样系统多为进样阀，较先进的仪器还带有自动进样装置；色谱柱系统除色谱柱外，还包括柱温控制器；数据记录系统可以是简单的记录仪，而很多仪器有数据处理装置。现代高效液相色谱仪都有微处理机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型高效液相色谱仪还备有自动馏分收集装置。下面简要介绍高效液相色谱仪的主要部件。
1．输液系统
（1）高压输液泵
高效液相色谱的流动相是通过高压输液泵来输送的。泵 （pump）的性能好坏直接影响整个高效液相色谱仪的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：流量精度高且稳定，其RSD应小于0．5％，这对定性定量的准确性至关重要；流量范围宽，分析型应在0．1～10m L／min范围内连续可调，制备型应能达到100m L／min；能在高压下连续工作；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。
输液泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。目前多用恒流泵中的柱塞往复泵，其结构如图13－10所示。通常由电动机带动凸轮转动，驱动柱塞在液缸内往复运动。当柱塞被推入液缸时，出口单向阀打开，入口单向阀关闭，流动相从液缸输出，流向色谱柱；当柱塞自液缸内抽出时，流动相自入口单向阀吸入液缸。如此往复运动，将流动相源源不断地输送到色谱柱。
图13－10 柱塞往复泵结构示意图
1．转动凸轮 2．柱塞 3．密封垫 4．液缸
5．入口单向阀 6．出口单向阀 7．流动相入口 8．流动相出口
柱塞往复泵的液缸容积小，可达0．1m L，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机的转速能方便地调节流量；其流量不受柱阻的影响；泵压可达40MPa，有的可达100MPa以上。但其输液的脉动性较大，目前多采用双泵系统来克服脉动性，按双泵的连接方式可分为并联式和串联式。
串联式双柱塞往复泵的两柱塞运动方向相反，泵1吸液时，泵2输液；泵1输液时，泵2将泵1输出的流动相的一半吸入，另一半被直接输入色谱柱。这样弥补了在泵1吸液时压力下降，消除脉动，使流量恒定。串联泵只有泵1具有一对单向阀。
为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，操作时须注意下列事项：防止任何固体微粒进入泵体；流动相不应含有任何腐蚀性物质；泵工作时要防止溶剂瓶内的流动相被用完；不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液；流动相应该先脱气。
（2）梯度洗脱装置
高效液相色谱洗脱技术有等度 （isocratic）洗脱和梯度 （gradient）洗脱两种。等度洗脱是在同一分析周期内，流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和p H等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂试样时，须采用梯度洗脱技术，使所有组分都在适宜条件下获得分离。梯度洗脱能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是可能引起基线漂移和重现性降低。
有两种实现梯度洗脱的装置，即高压梯度装置和低压梯度装置。高压梯度装置是由两台高压输液泵分别将两种溶剂送入混合室，混合后送入色谱柱，程序控制每台泵的输出量就能获得各种形式的梯度曲线。低压梯度装置是在常压下通过比例阀先将各种溶剂按程序混合，然后再用高压输液泵送入色谱柱。
2．分离和进样系统
（1）进样器
进样器是将试样送入色谱柱的装置。一般要求进样装置的密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。有进样阀和自动进样装置（autosampler）两种，一般高效液相色谱分析常用六通进样阀，大数量试样的常规分析往往需要自动进样装置。
用六通进样阀进样时，先使阀处于装样 （load）位置，用微量注射器将试样注入储样管 （sampling loop）。进样时，转动阀芯 （由手柄操作）至进样 （injection）位置，储样管内的试样由流动相带入色谱柱。进样体积是由储样管的容积严格控制的，因此进样量准确，重复性好。为了确保进样的准确度，装样时微量注射器取的试样必须大于储样管的容积。
有各种形式的自动进样装置，可处理的试样数也不等。程序控制依次进样，同时还能用溶剂清洗进样器。有的自动进样装置还带有温度控制系统，适用于需低温保存的试样。
（2）色谱柱
①色谱柱的构造。色谱柱 （chromatographic column）是色谱仪的最重要部件，它由柱管和固定相组成。柱管多用不锈钢制成，管内壁要求有很高的光洁度。高效液相色谱柱几乎都是直形，按主要用途分为分析型和制备型，它们的尺寸规格也不同。常规分析柱内径为2～5mm，柱长10～30cm；窄径柱 （narrow bore column）内径为1～2mm，柱长10～20cm；毛细管柱内径为0．2～0．5mm。细粒径的填料 （如1．7μm）常用短柱（5～10cm）。实验室制备柱内径一般为20～40mm，柱长10～30cm，生产用的制备型色谱柱内径可达几十厘米。柱内径是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。色谱柱两端的柱接头内装有烧结不锈钢滤片，其孔隙小于填料粒度，以防止填料漏出。
②色谱柱的性能评价。无论自己填装的色谱柱还是购买的商品柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件 （试样、流动相、流速、温度）下的柱压、塔板高度H和板数n、对称因子fs、保留因子k和分离因子α的重复性或分离度R。
色谱柱性能考察常用的试样和流动相主要有：甲苯、萘和联苯为试样，无水己烷或庚烷为流动相；烃基键合相柱，尿嘧啶 （k＝0）、硝基苯、萘和芴为试样，甲醇－水（85∶15）或乙腈－水 （60∶40）为流动相，或者用甲苯、萘和苯磺酸钠 （k＝0）为试样，以甲醇－水 （80∶20）为流动相。
3．检测系统
（1）检测器的主要性能
检测器 （detector）是高效液相色谱仪的三大关键部件之一。它的作用是把色谱洗脱液中组分的量 （或浓度）转变成电信号。按其适用范围，检测器可分为通用型和专属型两大类，专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，紫外检测器、荧光检测器属于此类，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应；通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，示差折光和蒸发光散射检测器属于此类。高效液相色谱的检测器要求灵敏度 （sen－sitivity）高、噪声 （noise）低 （即对温度、流量等外界环境变化不敏感）、线性范围（linear range）宽、重复性 （repeatability）好和适用范围广。几种常见检测器的主要性能列于表13－11，以下介绍四种检测器。
表13－11 几种常用检测器的主要性能
（2）紫外检测器
紫外检测器 （Ultraviolet Detector，UVD）是高效液相色谱中应用最广泛的检测器。它灵敏度较高，噪声低，线性范围宽，对流速和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。但它只能检测有紫外吸收的物质，而且流动相有一定限制，即流动相的截止波长应小于检测波长。
紫外检测器的工作原理是朗伯－比尔定律。紫外检测器包括固定波长、可变波长和光电二极管阵列检测器，固定波长检测器已很少用。
①可变波长检测器，是目前配置最多的检测器，一般采用氘灯为光源，能够按需要选择组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。但是，光源发出的光是通过单色器后照射到流通池上，因此单色光强度相对较弱。这类检测器的光路系统和紫外分光光度计相似。
②光电二极管阵列检测器 （Photodiode Array Detector，PAD或Diode Array Detec－tor，DAD），是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝。二极管越多分辨率越高。一般是一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光。例如，Agilent 1100HPLC的光电二极管阵列检测器的波长范围是200～900nm，有1024个光电二极管，平均0．7nm对应一个光电二极管。
光电二极管阵列检测器与二极管阵列分光光度计相似，只是以流通池代替了吸收池。其工作原理是：复光通过流通池被组分选择性吸收后，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的电信号强度，即获得组分的吸收光谱。经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图整合在一张三维坐标图上，获得三维光谱－色谱图 （图13－11）。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量。
图13－11 三维光谱－色谱图
（3）荧光检测器
荧光检测器 （Fluorescence Detector，FD）的灵敏度比紫外检测器高，选择性好，但只适合于能产生荧光的物质的检测。许多药物和生命活性物质具有天然荧光，能直接检测，如生物胺、维生素和甾体化合物等；通过荧光衍生化可以使本来没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围，例如氨基酸。由于荧光检测器的高灵敏度和高选择性，所以它是体内药物分析常用的检测器之一。
荧光检测的原理与荧光分析法相同，化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光或发射光；荧光强度 （F）与激发光强度 （I0）及荧光物质浓度 （c）之间的关系为：
F＝2．3QKI0εcl
式中，Q为量子产率，K为荧光收集效率，ε为摩尔吸光系数，l为光径长度。可见，在实验条件固定时，荧光强度与组分的浓度呈线性关系。
一般来说，激发波长 （λex）与化合物的最大吸收波长 （λmax）相近。实验中，可以把发射单色器固定在某一波长处，开大发射单色器的狭缝，改变激发波长进行扫描，得激发光谱，选择光谱上的峰对应的波长即为激发波长。发射波长 （λem）的选择是把激发单色器固定在λex处，改变发射光波长进行扫描，得荧光发射光谱，选择光谱上的峰对应的波长即为发射波长。
（4）安培检测器
电化学检测器 （Electrochemical Detector，ECD）包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。电导检测器主要用于离子检测。安培检测器 （amperometric detector）的应用最广泛，其灵敏度很高，尤其适合于痕量组分的分析；对具氧化还原活性的物质都能进行检测，如活体透析液中的生物胺，还有酚、羰基化合物、巯基化合物等，本身没有氧化还原活性的化合物经过衍生化后，也能进行检测。
安培检测器的工作原理是在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量 （Q）的大小符合法拉第定律：Q＝n FN。因此反应的电流（I）为：
式中，n为每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数，F为法拉第常数，N为物质的摩尔数，t为时间。当流动相流速一定时，
与组分在流动相中的浓度有关。
有各种不同构造的安培检测器，常见的薄层式三电极安培检测器的结构如图13－12所示。参比电极常为Ag－Ag Cl电极；辅助电极可以是碳或不锈钢材料，其作用是消除电化学反应产生的电流，维持参比电极和工作电极间的恒定电位；常用的工作电极有碳糊电极和玻碳电极。
图13－12 安培检测器结构示意图
1．工作电极 2．辅助电极 3．参比电极 4．色谱柱流出液入口 5．出口
（5）蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器 （Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）是20世纪90年代出现的通用型检测器。它适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、三酰甘油及甾体等；它对各种物质有几乎相同的响应。但是其灵敏度比较低，尤其是有紫外吸收的组分 （其灵敏度比UV检测约低一个数量级）；此外，流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。其工作原理 （图13－13）是将色谱柱流出液引入雾化器与通入的气体 （常为高纯氮，有时是空气）混合后，喷雾形成均匀的微小雾滴，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，而试样组分形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶，产生光散射，用光电二极管检测散射光。散射光的强度（I）与气溶胶中组分的质量 （m）有下述关系：
I＝kmb或lg I＝blgm＋lgk
式中，k和b为与蒸发室 （漂移管）温度、雾化气体压力及流动相性质等实验条件有关的常数。上式说明散射光的对数响应值与组分的质量的对数呈线性关系。
图13－13 蒸发光散射检测器示意图
1．由色谱柱流出携带组分的流动相入口 2．N2入口 3．雾滴 4．蒸发室 （漂移管）
5．组分的气溶胶 6．泵 （抽去溶剂） 7．光束
4．数据记录处理和计算机控制系统
现代HPLC的重要特征是仪器的自动化，即用微机控制仪器的斜率设定及运行。如输液泵系统中用微机控制流速，在多元溶剂系统中控制溶剂间的比例及混合，在梯度洗脱中控制溶剂比例或流速的变化；微机能使检测器的信噪比达到最大，控制程序改变紫外检测器的波长、响应速度、量程、自动调零和光谱扫描。微机还可控制自动进样装置，准确、定时地进样。这样提高了仪器的准确度和精密度。利用色谱管理软件可以实现全系统的自动化控制。
计算机技术的另一个应用是采集和分析色谱数据。它能对来自检测器的原始数据进行分析处理，给出所需要的信息，如二极管阵列检测器的微机软件可进行三维谱图、光谱图、波长色谱图、比例谱图、峰纯度检查和谱图搜寻等工作。许多数据处理系统都能进行峰宽、峰高、峰面积、对称因子、保留因子、选择性因子和分离度等色谱参数的计算，这对色谱方法的建立十分重要。色谱工作站是数据采集、处理和分析的独立的计算机软件，能适用于各种类型的色谱仪器。
HPLC仪器的中心计算机控制系统，既能做数据采集和分析工作，又能利用程序控制仪器的各个部件，还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分析。为了满足GMP／GLP（Good Manufacturing Practice／Good Laboratory Practice）法规的要求，许多色谱仪的软件系统都具有方法认证功能，使分析工作更加规范化，这对医药分析尤为重要。
13．3．4 高效液相色谱分析方法
1．定性和定量分析方法
高效液相色谱法的定性分析方法与气相色谱法的相似，可以分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法，后者又可分为化学鉴定法和两谱联用鉴定法。但是HPLC中没有类似于GC的保留指数可利用，采用保留值定性时，只能用保留时间 （或保留体积）和相对保留值，或用已知物对照法对组分进行鉴别分析。
为了保证定量分析的准确性和重现性，色谱系统应达到一定的要求。 《中国药典》（2010年版）规定的色谱系统适用性内容包括板数、分离度、拖尾因子和重复性。高效液相色谱法的定量分析方法也与气相色谱法的相似，常用外标法和内标法进行定量分析，但较少用归一化法。另外，对药物中杂质含量的测定常用主成分自身对照法，其可分为不加校正因子和加校正因子两种。当没有杂质对照品时，采用不加校正因子的主成分自身对照法，方法是将供试品溶液稀释成与杂质限度 （如1％）相当的溶液作为对照溶液，调整仪器的灵敏度使对照溶液主成分的峰高适当，取同样体积的供试品溶液进样，以供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质的含量。加校正因子的主成分自身对照法需要有各杂质和主成分的对照品，先测定杂质的校正因子，再以对照溶液调整仪器的灵敏度，然后测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质的含量。有关详细规定可参考 《中国药典》（2010年版）附录。
2．高效液相色谱分离方法的选择
选择HPLC分离模式的主要依据是试样的性质和各种模式的分离机制。试样的性质包括相对分子质量、化学结构、极性和溶解度等。现将其归纳于图13－14，可供选择方法时作为参考。
图13－14 HPLC分离方法的选择
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