影响细胞与支架材料复合的因素

细胞与支架材料复合是一项较为复杂的技术，细胞与支架材料的相互作用又是极为复杂的过程，至今尚未十分清楚，研究促进细胞与支架材料复合的有利因素及避免其不利因素，是工程化组织构建十分重要的问题。

一、支架材料的影响

（一）材料的含水量

在接种细胞前，均需要使支架材料复水，使含水量达到饱和，此时接种细胞悬液，常因支架材料含水量已达到饱和度，而使细胞悬液外溢，细胞不能被接种在材料上。正确的操作方法是用无菌吸水纸吸去一部分水分，使材料含水量减少，再接种细胞悬液，可使细胞接种量增加。

（二）材料表面物理性质

在多数材料表面上，细胞的黏附要求有血清存在，黏附的最适条件与蛋白质在材料表面的吸附能力有关。材料表面电荷量影响细胞黏附性。在无血清时，细胞在带正电荷的表面上的黏附增加。因此，可以提高表面带电基团数，来增加细胞的黏附特性。

（三）材料表面化学性质

1．合成聚合物　细胞与聚合物表面的黏附特性依赖于材料表面的化学性质。在聚苯乙烯和不同浓度的聚甲基丙烯酸羟乙基酸表面上培养细胞，发现细胞黏附性和伸展性均下降。

2．材料的生物可降解性　PLA、PGA及PLGA因其良好的生物相容性常用于制作细胞培养基底。软骨细胞在多孔的PGA或PLA泡沫中发生增殖并分泌葡萄糖氨基聚糖。培养在PLGA基底上的鼠肝细胞，4d后便有清蛋白分泌。新生鼠的成骨细胞可黏附于PLA、PGA及PLGA基底上并合成胶原。生物降解性聚合物在组织工程中的重要作用，是利用其降解特性，表面不断更新，为组织细胞提供不断变化的黏附和生长界面。

3．蛋白质吸附　来自培养基或培养细胞自身分泌的蛋白质，吸附在聚合物表面，改变材料表面的生物化学性质，进而影响细胞与材料的黏附。众多研究发现，细胞黏附和伸展同吸附在各种材料表面的纤维连接蛋白（fibronectin，FN）有关。细胞在材料表面的黏附、迁移依赖于预涂黏附蛋白，以及蛋白质介导的细胞黏附抑制剂的浓度。在细胞培养时，常在培养瓶预涂胶原蛋白。

（四）材料表面的改性处理

1．固定蛋白质　材料表面修饰（surface modification）影响细胞的黏附。材料表面加入化学基团，改变材料表面的湿润度，提高黏附蛋白对材料表面的吸附能力，进而影响细胞的黏附。如将胶原类蛋白质固定在材料表面，设计出接近组织中的条件反应界面，利于细胞黏附。

2．固定多肽类物质　将一些小的生物活性功能基团固定在材料表面，以研究其对细胞黏附的影响。如寡肽、糖类或糖脂等。某些短链氨基酸序列、细胞表面受体可影响细胞黏附。

3．固定氨基酸及其衍生物　对某些细胞，材料表面固定聚赖氨酸和聚鸟氨酸，可以提高细胞的黏附性。通过共价结合氨基基团也影响细胞的黏附。碳酸酯用来固定在聚丙烯酰胺表面，使细胞易于黏附、生长。

4．固定细胞生长因子　在材料表面固定生长因子，可以通过引发细胞黏附来促进细胞生长。胰岛素与黏附蛋白类（如FN、胶原）共同固定，诱导产生协同作用，使胰岛素活性增加。不同生长因子对细胞的黏附和生长的影响有一定的特异性。清蛋白、γ－球蛋白缺乏促进细胞黏附、伸展和生长的活性；胰岛素有较高促细胞生长能力；FN有较高促细胞黏附能力；两者共同固定于材料表面，产生协同作用，可增加胰岛素的活性。

（五）材料表面几何性质

材料表面粗糙时，可使细胞与材料接触的表面积增加，以促进细胞在材料表面的湿润作用，影响细胞的黏附强度。材料表面存在微小的刻痕或其他微结构时，细胞黏附性增强。通常细胞沿着表面纤维或刻痕取向黏附，形成接触引导（contact　guidance）。成纤维细胞在表面微结构为1～8μm时，细胞沿小凹糟定向排列。细胞黏附程度取决于凹糟的深度和间距。不同细胞在相同微结构表面黏附性不同，根据不同的种子细胞设计材料的表面几何图形。

（六）表面特化结构

采用微晶图技术（microlithographic technique），在材料表面制成具有确定尺寸、形状及图案的黏附和非黏附区域，其中具有黏附性的特化区域称为黏附微岛（adhesive micro－islands），可供单个细胞发生黏附。通过黏附微岛大小改变及岛内修饰，可以控制细胞在材料表面上的黏附和伸展面积。

二、细胞的影响

在体外培养条件下的细胞，虽然其形态和功能与在体内情况十分相似，但由于生长条件，营养环境的改变，再加上分离细胞过程中添加了很多非生理性因素，因此有可能改变细胞的一部分功能状态。上海第二军医大学在研究成纤维细胞时发现，成纤维细胞在几丁质材料上不能生长；四川大学华西医院研究肌腱细胞时发现，肌腱细胞在几丁质上也不能生长。其原因尚不清楚，可能是细胞对支架材料有某种选择性；或支架材料对某些细胞存在着非亲和性。在不同软骨细胞密度接种在支架材料上后形成关节软骨组织的研究中发现，低密度细胞不能形成关节软骨，只有在细胞密度达到1×107／ml才能形成关节软骨。四川大学华西医院用高密度细胞，不接种支架材料，在离心应力条件下能形成软骨组织，其DNA含量在培养2周时达到高峰；GAG含量在培养4周时达到高峰；DNA／GAG比值在培养8周时达到高峰，但其生物力学强度较正常软骨显著降低。

不仅细胞密度对构建组织工程化组织有影响，所选用的细胞传代代次也有十分明显的影响。有研究证明：组织工程软骨的构建以原代细胞为最好，5代以后的细胞不能形成软骨。

不同组织细胞在组织构建中需要满足一些基本条件才能较好地形成组织，如施万细胞在构建组织工程神经中，除了高密度细胞悬液外，在有可降解纵向纤维丝及人工合成细胞外基质条件下，形成组织工程神经的效果会更好。

在组织工程化组织构建中，外源性细胞的作用一方面为三维支架材料提供生命源泉；提供组织再生，修复的动力，同时也可能有激活局部组织细胞功能参与组织再生、修复、重塑的作用。有关这一方面的研究还有待深入进行。

三、培养方法的影响

（一）二维培养与三维培养

通常情况下，将细胞置于孔板、培养瓶、培养管内培养，或将细胞接种在不具有三维结构的膜性材料上培养，即二维培养。这种条件下，细胞只能从培养液中获取营养，依靠每隔2～3d交换培养液来补充新的营养成分及排除代谢产物。细胞在这种环境下，只能形成薄层培养物。如果继续培养，大部分细胞将要死亡、老化，不能构建成有三维结构的工程化组织。

将高密度细胞接种在具有一定空间结构，有一定孔隙率、孔径大小、孔间交通的支架材料上，细胞在模拟体内细胞的化学、物理和生物学条件下，在三维基质支架中进行培养称为三维培养。这种模拟在体细胞生长、分化及代谢的离体研究手段已广泛用于组织工程研究中。有学者在含有细胞外基质（ECM）成分的凝胶中培养成纤维细胞、胰腺细胞、上皮细胞和神经组织细胞，并广泛研究了细胞在三维凝胶中的运动、聚集和力学行为。不仅如此，培养在ECM凝胶中的各种组织细胞，经细胞复合培养还可形成多细胞结构。很多学者研究了在二维培养及三维培养条件下，细胞的改变。软骨在细胞单层培养中呈现反分化现象，而在琼脂糖凝胶中培养软骨细胞，可使它重新表达分化表型。胎儿纹状体细胞在三维羟基化琼脂糖凝胶中悬浮培养，约50%的细胞长出轴突。这种凝胶含0．5%～1．25%的琼脂糖，当琼脂糖浓度高于1．5%时未见细胞长出轴突。采用光聚作用制成的含黏附多肽的水溶性聚合物，如甘氨酸－精氨酸－天冬氨酸（RGD）附着于这种聚合物凝胶中的平滑肌细胞不仅成活，而且在培养过程中变长。PLA、PGA和PLGA、胶原等制成的纤维网和海绵，已被广泛用于研制细胞三维培养的基质支架，供细胞增殖和发挥生理功能，为组织的再生提供结构框架。

（二）动态三维培养装置

美国宇航局（NASA）生命中心研制并推出的组织／细胞三维高分化度的培养系统，为组织工程构建提供了新设备，其核心部分是旋转式细胞培养系统（rotary　cell　culture system，RCCS），简称旋转培养系统。该系统的圆柱状培养容器中放置细胞或组织材料，并用培养液充满整个容器。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转。细胞及组织在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，从而中和了大部分的重力效应，使之处于微重力状态。培养液及细胞／组织随容器一起旋转而不与容器壁和其他部件相撞，使得细胞维持在连续的自由落体状态，以此来模拟细胞的微重力环境。在这样的微环境中，细胞能以几乎接近正常的方式进行三维生长。旋转培养系统中的细胞／组织通过膜式气体交换器来吸入氧气和排出二氧化碳，通过循环装置补充新的营养物质及带走代谢产物。其组织的培养密度为1010～1011细胞／ml；细胞的培养密度为108细胞／ml。与普通细胞培养装置相比，有以下特点：

1．高分化度　旋转培养系统使具有高分化的人体组织能在实验室中生长。

2．模拟微重力　细胞外基质对于调节细胞骨架和细胞核基质蛋白非常重要。旋转培养系统模拟体内细胞所处的微重力状态，使分离原来在一起的细胞及细胞外基质成分的重力问题得到解决。

3．规模化　旋转培养系统可用于培养多种组织，而且可用于大规模生产，其细胞的成活率平均为97%，而且分化度高。

四、应力应变的影响

正常生理环境下的组织细胞均处在特定的应力、应变环境下，维持其形态、结构，发挥正常生理功能。在细胞与支架材料的联合培养中，在体外条件下，尽可能模拟体内应力、应变环境，对工程化组织的形成具有重要作用。

不同组织细胞在体内接受不同的应力，如关节软骨细胞在体内主要接受压应力。有研究者发现，在持续静压应力条件下，软骨细胞的合成能力受到抑制；在一定频率的循环周期动态压应力条件下，促进软骨细胞的合成功能。还有研究证明，应力能刺激骨细胞，引发成骨细胞产生某种介质吸引破骨细胞，使骨发生重塑。肌腱细胞在牵张应力作用下，细胞的黏附作用增强，分泌I型胶原能力增强，细胞沿着应力方向延长，细胞骨架也与应力方向一致，这对构建工程化肌腱十分有利。

研究已经证实，应力和应变是细胞代谢的一种刺激因子。实际上，Resnick等和Chien证实了内皮细胞核内存在着对剪切应力敏感的核心基因序列，机械应力与化学因素对细胞分子调控有相同反应。因此，与温度、pH、化学、生物因素一样，应力和应变是一种重要的影响细胞结构和功能的外界信息。

细胞三维培养的根本要求是模拟在体组织中细胞所处的生理环境，不仅仅要求空间上的三维。实际上，在体组织中细胞通常存在复杂的应力环境，如成骨细胞受拉伸或压缩应力，软骨细胞受压缩应力，肌腱和韧带中成纤维细胞受拉伸应力，血管内皮细胞受剪切应力等。因此，研究细胞三维培养应该考虑不同细胞所主要承受的应力环境。

长期以来，已有很多研究者致力于研究应力环境下细胞的三维培养。研究者将细胞与三维基质支架的复合物放入铸模里或者加以限制，使它们承受剪切应力、张应力，或在其生长过程中受到的已知力，在离体条件下促进细胞生长。在细胞生长的适合时机，施加应力作用是形成组织和推动基因活动的重要因素，这是因为细胞利用自分泌、旁分泌作用来满足自己和细胞相互间的需要。

细胞的增殖、分化和功能的发挥都是受基因调控的。应力对细胞功能的影响，可以在基因转录、翻译和翻译后，以及细胞及细胞间等不同水平上实现。大量研究证明，应力作用可以影响细胞内多种基因的表达。当内皮细胞受切应力作用后，有近50种细胞内基因表达的改变。心肌细胞受切应力作用后，也有多种基因表达的改变，其中多数表达增多。这些基因主要是与细胞增殖和细胞功能相关的基因。

实验证明，应力刺激引起的信号转导还影响蛋白质的翻译过程。应力刺激对蛋白质的分泌有促进作用。应力刺激对蛋白聚糖的持续性分泌有增强作用，这种作用可被与微管系统结构有关的抑制剂所阻断。应力刺激所引起的钙离子内流，是引起以微颗粒形式储存的蛋白聚糖释放的主要原因。

到目前为止，在细胞与支架材料的复合培养中，从方法学、细胞与材料的相互作用及其机制、应力应变与组织构建的关系及其作用机制、体外构建组织的最适条件等都尚不十分清楚，是一项十分值得深入研究的领域。