组织工程骨组织的体内构建

体内植入成骨实验是检验骨组织工程技术的金标准，体内植入实验从构建的目的方式上分为异位构建和原位构建。异位构建的目的是通过在肌肉内或皮下等非骨缺损部位植入细胞材料复合物，通过局部丰富的血循环营养种子细胞，促进组织工程骨的形成。异位构建在骨组织工程最初的发展过程中作为证明这一技术的可行性起到了重要的作用，但这种形式毕竟不是修复骨缺损，所以随着骨组织工程技术的发展，原位构建的模式逐渐占据了主导地位。原位构建因为是直接修复骨缺损，所以实验结果更有说服力。但原位构建的不利之处在于往往骨缺损区域的局部血循环较差，所以又涉及到促进组织工程骨再血管化的问题，在各种促血管化的手段中预构骨瓣这一异位方式又作为一种新手段登台了。

一、异位构建组织工程骨

（一）动物皮下或肌肉内异位构建组织工程骨

体内植入异位构建实验研究和临床初步应用研究骨和软骨组织工程是研究最早、最深入，也是目前发展最快的组织工程内容。

Nakahara将原代体外培养的骨膜源性细胞注入无胸腺小鼠的皮下，结果在该处产生了骨组织。由于单纯的、游离的成骨细胞在移植过程中易丢失，影响其成骨能力，Nakahara又将来源于出生7d的白色莱亨鸡胫骨骨膜培养的细胞与多孔性羟基磷灰石（剪成约3mm3的立方体）结合，再将该复合物移植到无胸腺小鼠体内检测其成骨能力。移植后第10天，就可在孔周围观察到编织骨的形成，而在孔的中央，可见大量软骨细胞，周围环绕着丰富的细胞间基质。14d时孔周已充满骨组织，孔的深部软骨已被侵入的血管和通过软骨内骨化的骨所取代。Nolan将脱钙骨基质与成骨细胞一同培养，也观察到成骨细胞不仅覆盖骨基质表面，而且长入骨基质间隙中，认为这种含成骨细胞的复合物是一种良好的骨移植代替物。Lang等从新生小鼠中分离培养成骨细胞，与羟基磷灰石、明胶复合后植入同种系小鼠内，发现能明显提高新的骨组织构建。Noshi等将BMSC／HA／BMP复合物植入大鼠皮下，2周时就发现有明显的骨组织形成，同时碱性磷酸酶与骨钙素在蛋白和基因水平上均有较高水平的表达，表现广泛的成骨活动，4周及8周时新生骨组织的量大大增加。BMSC／HA复合物移植组2周时未检测到新生骨组织，4周时有中等量的骨组织形成，8周时骨组织形成明显增多。而单用HA或BMP／HA复合物的对照组移植后始终未检测到新生骨组织。

原位皮下或肌肉内的组织工程骨的异位构建在骨组织工程技术出现的初始阶段以其操作简单，结果较为肯定，可重复性强等优势成为主要的验证这一技术的手段。之后由于基因工程等最新技术与组织工程技术的迅速结合，尤其是对种子细胞的改性的研究成为一个热点，作为一种简便易行的实验手段这种异位构建模式仍然有一定的价值。

（二）预构骨瓣的研究

众所周知，带有血运的骨移植比传统的骨移植修复骨缺损具有明显的优势。不带血运的骨移植只有诱导成骨作用，使移植骨的吸收和新骨生成同时发生，只能起到“同步取代”的作用。而带血管蒂的骨瓣移植，可以完整的对合两端填补在骨缺损处（如吻合血管腓骨移植修复股骨缺损），带血管蒂的骨瓣移植由于保证了骨的主要血液供应，移植后骨细胞及成骨细胞等组织细胞全部存活或大部分存活，其愈合过程类似于双极骨折（bifocal fracture）的愈合过程。这种修复是快捷的，已成为共识。受此启发，在组织工程骨的构建过程中为能达到带血管蒂的组织工程骨的局部转移或吻合血管游离移植修复骨缺损，学者们开始尝试将生物材料细胞复合体预先置于各种带蒂的筋膜瓣及肌瓣中，待其完成成骨及再血管化过程后再行移植。

1．概念　预构皮瓣就是将知名血管或含知名血管的筋膜、肌肉等组织移植到所需部位的某一层次，或将皮片移植于含有知名血管束的组织上（包括筋膜、大网膜）等，通过一段时间重新血管化而形成轴型皮瓣，在二期移位时携带下方的组织一并转移。而预构骨瓣就是用预构皮瓣携带并滋养骨块（图9－7）。

图9－7　猴背阔肌预构骨瓣

2．预构皮瓣的实验研究　Diller等（1966）证明狗的含血管回肠片段能维持预构皮瓣及皮下组织成活，同时提出了预构的概念。Washio（1971）预构以狗剥除黏膜的小肠片段携带腹壁组织移植成活，也确认了预构的理论。Erol（1976），将游离皮片直接移植于狗的股动、静脉表面，并形成局部皮瓣移位获得成功。Erk等（1983）应用同样技术植入皮瓣下轴心血管，扩大皮瓣和肌皮瓣的应用面积。Stal（1983）、Durate等（1987）应用轴型血管移位预构带有骨及软骨的皮瓣。通过这些不断的探索与研究，将轴心血管植入到所需供区而创造了新的轴型皮瓣供区（也就是将原随意型皮瓣供区改建成轴型皮瓣供区）。植入到新的轴型皮瓣供区的可以是肠系膜血管蒂、单纯血管束、筋膜血管蒂或肌血管蒂。

3．预构骨瓣在骨组织工程中的应用为了加速周围血管长入植入的组织工程骨组织，促进与宿主骨之间的融合，Casabona等设计出一种生物工程化预构骨肌瓣，即带血管蒂的组织工程骨，将经培养2周的人BMSC以2×105与羟基磷灰石复合后，植入裸鼠预先制备的带血管蒂的背阔肌瓣中，8周后组织学检查显示“预构工程化骨肌瓣”中有丰富的骨组织形成，血运丰富，细胞和材料复合体与肌瓣间形成良好的接触界面，形成工程化的带血管蒂的骨肌瓣，随后进行的带蒂骨组织移植修复骨缺损的效果良好。这使组织工程化新生骨组织完全替代自体骨移植成为可能，并为组织工程化新生骨组织的体内植入提供借鉴。Mankani等从转基因小鼠的长骨中收集BMSC并经培养扩增后，移植于裸鼠的颈总动脉、颈内静脉、主动脉及其伴行静脉等周围，对照组未植入BMSC细胞，术后4周至2年取材行组织学、免疫组织化学、血管造影分析。结果表明，治疗组86．5%（32／37）有血管化的骨岛形成，其血运由特定的颈总动脉分支单独支配，而对照组没有血管化的骨岛形成。成熟的血管化骨岛由发育良好的薄层皮质骨及松质骨构成，其成骨细胞来源于移植的BMSC，而造血组织来源于受体鼠。血管化骨岛早在术后4周就开始形成，随着时间的推移不断扩大，一直持续到108周。这说明鼠的BMSC可用来形成血管化的带蒂骨瓣，这些带蒂骨瓣可通过显微外科技术植入受体相应部位。

二、组织工程骨组织的原位构建

与其他医学领域的研究一样，组织工程骨在内的原位构建也是经历了从小动物体到大动物直至人体试验。这是一个循序渐进的过程，每一个阶段都出现了很多经典的实验，为进一步的研究奠定了扎实的基础。

（一）组织工程骨在小动物体内的原位构建

Vacanti等用种植有成骨细胞或软骨细胞的聚合物对裸鼠颅骨缺损进行修复，设立对照，结果成骨细胞移植组缺损部有软骨和骨生长，而对照组无生长。Vacanti等还利用骨膜成骨细胞和聚合物支架复合移植制成带血管蒂的新生骨组织。随后Cao等的研究中采用显微外科技术将带血管蒂的新生骨组织植入修复股骨缺损，发现移植骨成活并有良好的愈合界面。Beck等在修复兔桡骨1．5cm骨缺损的实验中，以磷酸三钙和羟乙基淀粉作为TGFβ1的载体，采用TGFβ1／BMSC／载体复合物修复骨缺损，结果显示其成骨能力与自体骨移植相似，其成骨量、骨缺损修复处的机械强度与所形成的主要板层骨的组织学结构均明显优于TGFβ1／载体复合组及空白对照组。Breiybart等用骨膜细胞与PGA材料复合，修复兔颅骨直径为15mm的缺损，对新生组织进行组织学、生物化学及放射线检查，发现在新骨形成的各个阶段，组织工程化新生骨组织的骨含量、胶原含量及放射线密度均大于对照组，12周时骨缺损处基本被新生骨组织填充。Bruder等将多孔陶瓷负载培养扩增的人BMSC植入无胸腺兔一侧胫骨缺损处，对侧单用多孔陶瓷载体作对照，负载BMSC的实验侧术后8周有新骨形成，12周时生物力学测试实验侧修复的胫骨强度远远大于对照侧。Shang等将成年羊制成直径为20mm的双侧顶骨全厚骨缺损，实验侧采用自体培养扩增的BMSC复合藻酸钙修复，对照侧单用藻酸钙及空白对照。术后6周实验组可检测到新骨形成，18周时新生的组织工程骨组织更为成熟，三维CT扫描显示实验组骨缺损几乎完全修复。Isogai等用新鲜牛骨膜包饶PLA和PGA形成的聚合指骨体，又在PGA聚合片中种植软骨细胞和腱细胞，体外缝合装配形成含远节指骨、中节指骨和指间关节的模型。并将此模型植入去胸腺小鼠的皮下，20周后形成了具有人指骨及指间关节形状的三维结构。组织学检查显示有成熟的关节软骨、软骨下骨和腱帽，结构与人指骨及关节极其相似。说明用组织工程方法可构建复杂的骨关节结构。

（二）组织工程骨在大动物体内的原位构建

戴克戎利用腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2（Adv　hBMP　2）基因转染的组织工程化人工骨对羊胫骨干骨缺损模型（2．6cm）修复，结果证明hBMP　2基因修饰的组织工程化人工骨可以修复羊胫骨的节段性缺损。阳富春于猕猴胫骨结节抽取MSCs并使诱导分化为成骨样细胞，用5－溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记，培养后与人源生物衍生骨材料体外复合构成组织工程化骨，植入15只异体猕猴修复桡骨2．5cm长段骨缺损作为实验组；用单纯生物衍生骨材料修复对侧同样骨缺损作为对照组；另取2只猕猴双侧桡骨同样部位和大小骨缺损旷置作为空白组。结果显示实验组和对照组术后1、2和3周移植物周围组织反应较明显，6周后明显减轻，12周时基本消失。实验组标记成骨样细胞于术后6周仍存在，术后12周基本消失；骨缺损部位骨样组织、软骨、编织骨和板层骨出现时间均较对照组早，且骨愈合时间提前3～6周。实验组骨缺损以多点方式直接成骨，对照组则从两端以“爬行替代”方式成骨。空白组术后12周骨缺损均无愈合。

骨组织工程动物实验中骨缺损模型有多种。按骨缺损的类型分洞缺性骨缺损和段缺性骨缺损，前者有长骨、扁骨和不规则骨的骨与骨膜缺损，后者是长骨的骨与骨膜缺损；按动物体积分：羊、狗、猪是常用的大动物，鼠、兔是常用的小动物。鼠、兔的颅骨洞缺性骨缺损模型与兔尺、桡骨段缺性骨缺损模型在临床前动物实验中是最常用的。狗、猪的下颌骨或股骨洞缺性骨缺损模型可以在一侧骨上做多个缺损模型，以上模型均可以用大样本实验，易于统计分析，骨缺损部位不需内固定，简化了实验操作，减少了影响因素与误差。以上模型仍难满足临床实验要求，具体表现为成骨量少、与临床实际不相符。临床发生率较高骨缺损是负重或应力集中部位的管状骨的大段段缺性骨缺损，多由创伤、感染造成，治疗难度大。近期发展起来的骨组织工程是将自体种子细胞体外扩增后与生物材料复合，植入骨缺损部位修复骨缺损，在理论上是该类型骨缺损修复的最理想治疗模式。从临床的角度出发，对骨组织工程修复该类型骨缺损的动物模型要求：①骨缺损量要大；②相似的软组织与力学环境；③考虑内外固定影响。目前一些骨组织工程研究对成骨量小的模型能得到比较理想的结果，在成骨量较大的模型上结果不理想，这是因为种子细胞体外培养的时间短，本身成骨潜能易于保持，如用于大量骨缺损修复，要求成骨量大，为达到一定数量，种子细胞的体外培养时间将增加，成骨能力会降低。洞缺性骨缺损与段缺性骨缺损的生物力学环境是不同的，段缺性骨缺损的轴向应力会影响新骨的形成，而洞缺性骨缺损缺乏应力的刺激。按目前技术，较大骨缺损修复后的固定仍必须依靠内外固定，要考虑不同固定材料、方式与生物材料／种子细胞的相互影响。因此，大体动物长管状骨的段缺性骨缺损模型是与临床实际最相符合的模型。

（三）组织工程骨临床的异位构建

杨志明等采用组织工程肋骨成功治疗了1例左胸壁巨大韧带样纤维瘤的女性患者。术前6周采用自体髂骨穿刺获取骨髓，分离培养BMSC，经诱导分化成骨样细胞作为种子细胞，与经去细胞、去抗原的生物衍生骨支架在体外联合培养，构建成3条长10cm的组织工程肋骨。术中在切除重达2　6kg肿瘤及被侵犯的肋骨之后，以3条组织工程肋骨重建肋骨支架，用同侧腹部带蒂皮瓣修复胸壁皮肤缺损。术后1年肿瘤无复发，心肺功能正常。Quarto等报道了3例分别为骨延长失败所致的右胫骨中段4cm骨缺损、右尺骨远段4cm创伤性缺损以及右肱骨粉碎性骨折所致7cm缺失病例，应用自体骨髓基质干细胞和羟基磷灰石构建的组织工程骨修复，取得了成功。经X线照片和CT扫描显示，3例术后2个月沿植入组织工程骨都有丰富的骨痂形成，组织工程骨与宿主骨的界面也见很好骨整合。Vacanti等报道了1例创伤性左拇指远侧指骨、伸肌腱及背侧皮肤撕脱伤用组织工程方法修复后的早、中期效果。伤指先用腹部带蒂皮覆盖，断蒂后用自体左桡骨骨膜来源的成骨细胞经培养扩增后和多孔珊瑚HA预制的指骨形植入物复合，再植入拇指皮瓣袋内。修复后的拇指恢复了正常的长度、捏拿功能和一定的关节活动度。虽然植入10个月后的手术活检显示仅5%的植入物有新骨形成，术后28个月的随访X线照片检查指间关节有狭窄，检查拇指的捏压力只有正常的25%，指间关节仅15°的被动活动度，但无疑显示了组织工程构建骨在临床应用的潜力。

骨组织工程技术的最终目的就是其在临床上的广泛的应用，随着组织工程基本技术的成熟及在动物体内实验的不断成功，越来越多的研究者把目光投入到人体试验中去。但是相关的试验规范和法律法规的建设仍然需要加强。