组织工程骨的检测技术

组织工程骨的检测技术_组织工程学实验技

一、成骨细胞的鉴定

1867年，Cohnheim首先提出了骨髓内含有MSCs的观点。Feiedenstein在20世纪70年代发现骨髓中的单个核细胞经培养可分化为成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞等，Owem称这种细胞（能分化为定向祖细胞）为骨髓MSCs。

近10年来，对各种诱导物的作用进行了较多的研究。Kamalia等通过实验发现皮质醇能调节正在分化细胞的基因表达，诱导基因组目的序列皮质醇受体的亲和性，增加APase活性，促进集落形成，因此，皮质醇有诱导骨髓MSCs分化为成骨细胞作用，促分化的同时也抑制了骨髓MSCs增生。Walsh等发现生理需要量的地塞米松（DEX）没有促进细胞数量的增加，但有促进它向成骨方向分化和成熟的作用，而超生理量的DEX则对成骨细胞的更新和骨髓MSCs的成熟，保持其子代的特性有影响，但分化成成骨细胞的数量却减少。Otsuka等证实维生素C能通过诱导成骨细胞特异性分化蛋白基因的表达来诱导碱性磷酸酶（ALP）活性的增加，促进ST2细胞（一种鼠的骨髓MSCs）向成骨细胞的转化。同时证实维生素C能增加钙盐的沉积和促进钙化骨结节的形成。Mc　Qillan等揭示β－甘油磷酸钠可以为骨细胞分化和增殖提供磷原子，能增加ALP在成骨细胞中表达从而促进生理性钙盐的沉积、促进钙化。1，25（OH）2维生素D3可促进骨祖细胞增殖，它还可以在无DEX、17β雌二醇、维生素C的情况下诱导MSCs向成骨细胞转化并能增加ALP的活性，且对MSCs向成骨细胞分化的影响成剂量依赖性。

（一）兔骨髓基质干细胞的诱导分化与鉴定

1．取材　4～8周龄健康新西兰大白兔，雌雄不限，自股骨大转子部抽吸双侧股骨骨髓共3ml，混入含15%胎牛血清的1　640完全培养基（青霉素和链霉素各100U、维生素C　50μg／ml）10ml中反复抽吸吹打。

2．细胞培养　将上述细胞悬液经4号针头反复抽吸制成单细胞悬液，以3×106／ml细胞数接种入50ml培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中，5d后半量换液（1　640完全培养基），以后2～3d全量换液1次。待细胞汇合成单层后消化，以1×105／ml接种于培养皿中，进入传代培养。传代培养使用条件培养基（1　640完全培养基中加入地塞米松10－8　mol／L、β－甘油磷酸钠10mmol／L）。细胞持续培养20～30d，常规3d换液1次。

3．鉴定　①倒置显微镜逐日观察细胞生长情况及形态变化特点。②扫描电镜观察，分别将培养6、12、20d长有细胞的盖玻片取出，经戊二醛固定、丙酮脱水、乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。③透射电子显微镜观察，取对数生长期的细胞消化，戊二醛前固定，四氧化锇后固定、丙酮脱水，环氧丙烷置换，树脂浸透，经包埋、聚合后超薄切片，铀、铅染色，透射电镜观察。④碱性磷酸酶染色，将培养3周的附有细胞的盖玻片取出，采用改良Gomori钙钴法测定，每张盖玻片随机计数100个细胞，计算ALP阳性细胞率。⑤钙结节染色将传代培养3～4周的附有细胞的盖玻片取出，Von－Kossa染色。

（二）人骨髓基质干细胞的诱导分化与鉴定

1．取材　在无菌条件下，以穿刺针垂直穿刺髂骨骨髓腔，刺入骨髓腔2～3cm，骨穿针后套20ml注射器，注射器事先吸入1ml抗凝液（组成：每1　000U肝素加入1ml DMEM无血清培养液），将抗凝液注入骨髓腔，反复抽取骨髓20ml。

2．细胞培养　立即注入2只50ml离心管中，事先加入10ml抗凝液，1　000r／min，离心10min，弃去上清液，以PBS清洗3次，取出上层脂肪及组织液，下层即为包含MSCs的细胞层。将骨髓基质细胞转移至8个培养皿（20mm×100mm）中，加入骨髓基质细胞培养液（含20%胎牛血清DMEM培养液），置CO2孵箱中进行培养。5d后换液，以去除未贴壁血细胞，以后每3d换液1次。

3．鉴定　①倒置显微镜：观察原代及传代细胞的生长和发育情况，主要观察细胞的形态变化。原代细胞18～20d可长满培养皿，细胞接近长满后用0．25%胰酶消化传代，以1×104／cm2密度接种于培养皿中，倒置显微镜下观察。②生长曲线测定：取生长良好的第4代细胞消化制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105／ml，接种于100mm培养皿，每皿接种2ml，置于CO2孵箱进行培养，每日取出3个培养皿，0．25%胰酶消化，计算每皿细胞数，取均值。以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。计算倍增时间。连续观察17d。未计数细胞每3d换液1次。③碱性磷酸酶染色和HE染色：取第4代细胞，胰酶消化后，接种到小的盖玻片上，细胞长满后取出，PBS漂洗，95%乙醇固定，行碱性磷酸酶染色和常规HE染色。④矿化结节染色：取第4代细胞，胰酶消化，接种在25ml培养瓶中，用矿化液（含20%胎牛血清、2nmol／Lβ－甘油磷酸钠、50μg／ml维生素C、10nmol／L地塞米松）连续培养30d，在倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。取30d标本，95%乙醇固定后行Von－Kossa染色，观察矿化结节形成情况。

二、体内成骨能力的鉴定

（一）放射学检查

术后按设计拍手术肢体正侧位X线片。麻醉后固定，条件（羊）：电压55kV，电流55mA，曝光时间0．3s，焦距900mm。所有X线片用光密度仪做光密度测定，为消除每次拍片显影剂条件等的不同，每张片测定骨缺损中央与相邻软组织的光密度，骨缺损光密度与软组织光密度的比值做比较（图9－10）。

（二）生物力学检测

本实验适于修复动物四肢长管骨段缺性骨缺损。取剔除软组织材料，测量外径和长度，湿润条件下在材料试验机上测定所取检测材料垂直最大压缩载荷及弹性模量，以100N／s加载（羊胫骨），做三点弯曲实验测试载荷（F）并计算弯曲应力（δ），δ＝8FL／лd3，其中L为试件固定距离，均为100mm，d为骨缺损断裂处的外径（图9－11，彩图24）。

（三）组织学检查

图9－10　组织工程骨修复山羊胫骨骨缺损的放射学检查

图9－11　组织工程骨修复山羊胫骨骨缺损的生物力学检测（压应变）

1．软切片　体积分数10%的中性甲醛溶液固定，常规酸性脱钙液脱钙，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色光镜观察。

2．硬切片　4%多聚甲醛固定后常规梯度乙醇脱水，有机树脂包埋。于硬组织切片机切成5μm超薄片12张，分别行Masson染色、甲苯胺蓝染色，光镜下观察骨缺损愈合情况、材料变化、周围炎性反应。

（四）电镜观察

标本经3%戊二醛固定，PBS液冲洗，0．1%EDTA脱钙，1%锇酸固定水洗，梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透，包埋，半薄切片定位，超薄切片，电子染色，电镜观察。

三、组织工程骨再血管化的鉴定

（一）放射性核素骨显像监测

实验动物（山羊）麻醉后，将其俯卧于木架上，四肢固定，探头距双胫骨100mm，经小腿浅静脉注入Tc99m－MDP（185MBq／10kg）4h后检查，以1帧／5min采集一幅静态图像，能峰140keV，窗宽20%，矩阵512×512，缩放1．0。影像处理：以术侧缺损区10mm× 20mm大小的矩形为感兴趣区，镜像法取健侧感兴趣区。使用感兴趣区（ROI）计数，计算T／NT比值（术侧ROI单位像素的计数（每pixel）／健侧ROI单位像素的计数（每pixel）进行定量测定，以进行对比分析（图9－12，彩图25）。

图9－12　组织工程骨修复山羊胫骨骨缺损的放射性核素骨显像监测（红色区域显示血供丰富）

（二）墨汁灌注

动物（以观察大鼠颅骨为例）在被处死前均在全麻下显露双侧颈总动脉（或主动脉、股动脉，视动物情况而定），向动脉远心端插入两根直径为1mm的硅胶管，结扎双侧颈总动脉近心端，固定远心端插管并快速推注1　500U肝素及20mg戊巴比妥钠以处死动物。迅速断头并放出余血，自双侧插管内缓慢低压灌注预热至39℃的墨汁／甲醛混合液（墨汁∶甲醛＝6∶1，直至大鼠头面部皮肤黏膜及眼底均呈现黑色为止（约需5ml）。静置2h后剥离头骨并在体积分数10%甲醛溶液缓冲液中固定3d，制成80μm脱钙切片及100μm不脱钙磨片，或系列脱水透明后保存于冬青油中以观察墨汁灌注情况（图9－13，彩图26）。

图9－13　组织工程骨修复山羊胫骨骨缺损后墨汁灌注（可见墨汁灌注显示血管）

（三）特殊染色

Van　Gieson染色能特异的显示血管壁，可以用作观察切片内的血管化情况。骨组织固定于10%甲醛液，按常规脱水包埋，切片脱蜡。用Weigert铁苏木精液染5～10min，流水稍洗，1%盐酸乙醇迅速分化，自来水冲洗。用Van　Gieson液（甲液：1%酸性品红水溶液，乙液：苦味酸饱和水溶液，甲、乙两液分瓶盛放。临用前取甲液1份，乙液9份混合后使用）复染约30s。倾去染液，95%乙醇分化，无水乙醇脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。通过对不同层面切片的成骨面积及血管数量和血管横截面积比的测定，可用于观察成骨及血管生成情况。

（南方医科大学附属南方医院　陈　滨）

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