心肌组织工程研究

对晚期心功能衰竭的患者而言，心脏移植是首选的方法，但因心脏移植供体缺乏、免疫抑制剂引发的并发症以及移植器官衰竭等因素的限制而不能广泛应用，绝大多数患者在等待中死亡。其他的治疗方式，如机械辅助装置及异种移植等，并不能有效地缓解心功能衰竭的症状。通过在病变局部直接诱导心肌细胞的增殖来提高心功能，可能是一种最直接的治疗方式，但心肌缺乏干细胞，且成熟的心肌细胞均已分化完全，不能进入细胞循环，因此心肌缺乏再生能力，心肌梗死后心肌细胞不可逆丧失，只能依靠成纤维细胞生长形成瘢痕来修复替代。

近年来，国内外心肌组织工程研究取得了明显进展，展现了良好的临床应用前景。目前心肌组织工程的研究主要采用了以下两条基本途径：①通过细胞移植的方法；②通过将细胞接种到可降解支架材料上，在体外再造出心肌组织，即组织工程心肌。

一、细 胞 移 植

将体外纯化、培养扩增的心肌细胞或非心肌细胞移植到受损心肌组织中，用新生的肌组织替代纤维化组织，从而改善心功能。

1．心肌细胞　Li分离、培养了心房细胞，并将自体的成熟心肌细胞注入到冻伤的心肌内，术后不同时间检查，发现与对照组相比，实验组动物心功能得到了一定程度的提高。此后他们在成年猪的心脏内制备心肌梗死模型，同时从室间隔收集细胞，然后将这些细胞用BrdU标记，注入到梗死区。结果显示，接受移植细胞区域的心肌运动得到加强，灌注分数提高。Yokomuro等还将冷冻保存的心肌细胞注射到梗死的心脏，发现了活的移植细胞。而Reinecke等比较了胎儿、新生儿及成人的心肌细胞在植入正常的和冻伤的心肌后的存活情况，发现在所有的环境中，只有胎儿和新生儿的细胞形成了活的移植物。

现在已有许多实验结果证实，使用胎儿或新生儿的心肌细胞可增强心脏功能。Soonpaa等第一个报道了胎儿心肌细胞可以被移植并与小鼠正常心肌整合。此后，科研人员进行了大量异基因心肌细胞移植实验，结果表明：细胞移植后，在受体心肌中可以发现移植的细胞，且心脏功能得到明显改善。众多的研究结果表明，胎儿心肌细胞是最有价值的移植细胞来源，因为它们能够和受者心肌在结构和功能上整合。最早发表的有关将细胞移植到病损心肌后，心脏血流动力学改善的研究就是使用了胎儿的心肌细胞。

国内外转基因胎儿心肌细胞的移植实验结果表明，在移植物和同基因宿主的心肌间存在缝隙连接。另据报道，转基因动物的细胞和宿主猪的心室细胞间也可形成初步的连接，移植到猪左心室壁的人胎儿心肌细胞能够存活。但是，到目前为止，来自转基因动物的心肌细胞系仍未建立起来。至于作为异基因移植来源的其他物种（如猪），从长期来说能否作为供体来源，仍需要进一步探讨，因为除了存在免疫学上的障碍外，还有潜在的病原微生物传播的威胁。

2．骨骼肌肌原细胞　1995年，Chiu等从狗骨骼肌中分离出了肌原细胞，将其标记后移植到自体心肌受损部位，结果发现，肌原细胞分化成了具有心肌细胞结构特点的细胞。Corsin将骨骼肌肌原细胞移植到大鼠心梗部位，用超声心动图检查评价移植前后心脏功能。发现移植了细胞的实验组左室射血分数从40．4%提高到47．3%，而对照组则从40．1%下降到36．7%。

1998年Dorfman等采用DAPI标记的卫星细胞再次证实了这个结论。Taylor等将自体骨骼肌肌原细胞移植到兔因冻伤而坏死的心肌部位，并对心功能进行6周的体内监测，在坏死区发现了保留骨骼肌和心肌细胞特征的纹状细胞。实验还证明，进行肌原细胞移植的动物，心脏功能得到明显提高。正是由于位于骨骼肌质膜和基板之间的这些卫星细胞能够与周围的肌原细胞融合或与损伤的肌纤维融合再生，而且在进行体内移植前，还可以在体外对其进行大规模扩增与基因修饰，因此，骨骼肌肌原细胞已经成为细胞移植的主要细胞来源之一。

3．骨髓间充质干细胞　骨髓间充质干细胞在体外经5－氨胞苷诱导后具有分化成心肌细胞的潜能。在鼠心梗模型中，Orlic等用骨髓间充质干细胞移植到梗死区域，发现由骨髓间充质干细胞分化出的心肌细胞占梗死部位的68%，且见新生血管生成，表明受损心肌得到修复并形成有功能的心肌组织。研究人员还将大鼠的骨髓间充质干细胞在体外扩增后标记并注入心肌，发现在心肌的环境中骨髓间充质干细胞可以表达心肌细胞的表型。这些细胞可以通过骨髓穿刺反复获取，并可在体外大量扩增，且不需要免疫抑制，因此是细胞移植中前景广阔的细胞来源。

4．成纤维细胞　Lattanzi等曾报道了一种可以高效地将人成纤维细胞转变成心肌细胞的方法。该方法主要通过以腺病毒介导的MyoD基因转染来实现。结果显示，转化细胞和同一物种原来的肌细胞在形态结构和生化特征上十分相似，将其注射到免疫缺陷小鼠的骨骼肌中时，细胞也形成了正常的肌纤维。研究者们还使用同样的技术将心肌成纤维细胞转变为了肌原细胞。另外Tam等也报道，通过反转录病毒转导MyoD基因，心脏的成纤维细胞可以转变为有功能的骨骼肌细胞。这提示转染的MyoD基因在治疗心肌损害时可以诱导骨骼肌的分化，这是由于MyoD家族可表达生肌转录因子，它们是诱导骨骼肌分化的重要物质。

二、通过细胞－支架复合体方式再造心肌组织

通过细胞－支架材料复合体的方式再造心肌组织是心肌组织工程的第二条途径。能否再造出心肌组织，关键取决于是否选择了性能良好的细胞支架材料、是否拥有足够数量的种子细胞以及是否能够获得优良的复合体体外培育条件。

1．支架材料　用于心肌组织工程的支架材料必须具有生物相容性，并能满足细胞在营养和生物学上的需要。生物学来源的细胞支架材料还要求具有生物可降解性。对此类材料的研究已取得了一些成功，但仍存在一些问题有待解决，如在支架材料制备过程中，如何去除能够引起免疫排斥反应的细胞而不破坏细胞外基质。

（1）去细胞基质：取自于异种动物的支架材料，为消除其免疫原性，需要经过甲醛溶液或戊二醛去蛋白处理，但可能导致支架材料因蛋白交胶而变硬，顺应性降低。生物合成材料上残余的细胞有使材料钙化、被免疫识别的副作用，因而需要进行脱细胞处理，天然的血管经处理后可用作构建组织工程学血管的修复材料，包括心脏瓣膜或血管移植物。Goldstein等研究了异种去细胞基质构建组织工程学材料支架，猪瓣膜（非冠状动脉瓣）去除其细胞后的基质，已经减轻了免疫原性。在体外将主动脉瓣和二尖瓣重新缝合构成一个新的三尖瓣后，将其移植至新生绵羊以及患者，观察其形态学和血流动力学变化，结果发现，采用猪的基质构建的组织工程学瓣膜功能良好，与正常的主动脉瓣相似。移植于绵羊右室流出道的瓣膜基质约80%被成纤维细胞或肌纤维细胞重新细胞化，移植物150d后无钙化，336d后仅有轻度的钙盐沉着。超声心动图证实组织工程学瓣膜在移植期血流动力学表现正常。人类的移植试验表明，构建的瓣膜体内的功能有效期达9个月之久，组织工程学异种心脏瓣膜作用与自体瓣膜相似，有可能用于临床瓣膜疾病的替换治疗。

（2）完全自体化的支架：心血管组织工程学三维支架材料主要用作生理支持和细胞附着的模板，目前使用的支架都会有潜在的免疫性，并且可引起炎症反应和毒性降解，Ye等尝试采用自体细胞构建三维支架，将降主动脉的成肌纤维细胞分离出来，并在培养皿中进行培养扩增，形成一层细胞层，再将其折叠成4层，继续培养4周。结果显示培养的细胞形成多层结构，外面有基质包绕折叠后的细胞层进一步发展，形成牢固且有一定柔性的组织，细胞外基质含量与天然组织相似，并可见胶原纤维。这些结果表明，改进的细胞培养技术可采用人类主动脉成肌纤维细胞构建具有组织样结构的生物材料，在此基础上可完全采用人的自体细胞构建三维的心血管修复材料。

（3）高分子材料支架：高分子材料支架一直被用作构建组织工程学血管的支架，可降解的高分子材料如聚羟基乙醇（PGA）和聚丙醇酸等使用得比较广泛。PGA和聚丙醇酸的混合材料用于肺动脉瓣瓣叶及肺动脉的替代治疗效果较好，若用于体循环系统则可有动脉瘤形成，Shum－Tim等对此作了改进。采用PGA和聚羟链烷酸酯（polyhydroxyal－kanoate）的复合高分子材料作支架，缝合成4cm长，内径7mm的管道。其内层随机植入PGA网，可提供三维支架。供细胞附着和生长，6～8周即被水解，实验结果显示移植到腹主动脉部位的组织工程血管张力、切应力等特性均和正常血管相似。这种高分子材料可用作构建组织工程血管的良好支架。

2．构建细胞与支架材料的复合体　采用组织工程技术在体外复制的心肌组织具有固定的组织结构，与单纯的细胞悬液体内移植相比，前者体内移植后更易于产生显著的心肌扩大。Li等将胎鼠心室肌细胞，胃平滑肌细胞、皮肤成纤维细胞、成年人心房和心室肌细胞接种到可生物降解的明胶网格，并研究了其体外特征，结果表明，除成熟心室肌细胞外，所有的细胞类型都在网格内得到一定程度的增殖。将载有胎儿心肌细胞的支架移植到皮下组织或心肌瘢痕组织，尽管未发现心室功能的显著提高，但发现细胞在移植物内存活并与受者心肌组织整合在一起。Leor等将胎儿心肌细胞接种到多孔明胶支架上，然后将此复合物移植到心肌瘢痕中，发现移植物内有广泛的新生血管形成。对照组动物出现了左心室扩张，心功能不全等症状，而移植组动物则未发生上述症状。

3．在生物反应器系统内培育细胞－支架复合体　用于组织工程的生物反应器大致可以分为灌注式、搅拌式以及旋转式三种类型。它们是细胞在体外大量扩增并产生新生组织的重要工具。在搅拌式生物反应器内培养复合体与在普通培养瓶内培养相比，具有明显的优势：前者能使新陈代谢的参数维持在生理范围内，并可使复合体内细胞浓度增加；有利于供氧，使细胞形态拉长。旋转式生物反应器与搅拌式生物反应器以及培养瓶不同，液体的流动为层流，而且是动态的，因此与前两者相比，其中培养的复合体具有更为活跃充足的氧代谢。

心肌组织工程是一个相对较新的领域，国外在体外构建具有三维结构的心肌组织研究仅有少量报道。1997年，Freed和Vunjak－Novakovic将新生鼠心肌细胞接种到可降解聚合物支架——PGA支架上，形成两者的复合体，并将复合体在旋转生物反应器内进行培育，体外培育数周后，可见在生物反应器内形成了具有收缩能力的心肌组织。A－kins等将心肌细胞接种于胶原纤维和微载体上，在旋转生物反应器内培养，研究它们的代谢酶的活性，并与单纯培养瓶内培养进行了比较。Rebecca等对细胞接种和组织培养条件如何影响工程化心肌复合体结构和功能进行了研究，证明在旋转式生物反应器中培养的复合体在体外培育1～2周后，复合体开始表达心肌特异性蛋白，并呈现出心肌的超微结构特点，同时，移植细胞开始具有与自体心肌细胞相似的代谢活性，这对构建新的可供临床应用的组织工程化心肌组织将会有所帮助。

心肌组织工程研究尽管只有10年左右时间，但却引起了国内外众多科研人员的重视。目前国外心肌组织工程研究在基础实验方面已取得了一定进展。据报道，美国的组织工程领域研究人员目前正在开展在实验室里培植人类整个心脏的研究，这项研究预期10年，耗资1　000万美元。国内心肌组织工程研究尚处于起步阶段。随着医学及各门相关学科的迅猛发展，预计在不远的将来，心肌组织工程必将为众多心脏病患者带来福音。