平滑肌组织工程

平滑肌的组织工程研究主要涉及到一些含平滑肌的肌性管道组织或器官的构建研究，如血管、食管、肠道、膀胱、输尿管、尿道等。组织工程血管的研究开展较早，本书中另有章节详述。下面分别简要介绍组织工程技术在食管、膀胱、输尿管等方面的研究。

一、组织工程食管研究

食管是较常见的消化道肿瘤发生部位。中国是食管癌的高发区，地区差异大，某些地区发病率高达10%，全国每年有20万人死于食管癌。目前，手术切除肿瘤是食管癌最重要与首选的治疗方式。手术切除术后的食管缺损由胃、空肠、结肠替代食管（食管成形术），最大的问题是“以伤治伤”，而且扰乱了消化道正常生理功能，术后胃食管反流、脂肪、维生素代谢障碍等，严重影响了患者生存质量。食管成形术手术范围大、创伤大、手术难度大，因食管癌患者多是老年人，体质弱、营养差，往往不能耐受再手术而延误治疗。术后还有许多并发症是致命的，如术后吻合口瘘的病死率高达50%；对上、中段食管癌以及晚期的下段食管癌，手术切除可能性小，这类患者常因进食困难而死于营养不良，已成为危害人民健康、影响生活质量，亟待解决的重大问题。寻找简便、安全、有效的食管代用品已成为治疗食管癌、提高患者生活质量的关键。运用组织工程技术构建有活性的人工食管，将为食管缺损的修复提供一条崭新的道路。

组织工程化血管是研究得较为透彻的组织工程化管道，已在管道支架制作、细胞－材料复合方面积累了一些资料。在血管这样较小口径管状假体的研究中，目前的主要困难是管道通畅度。而在较大直径的管道假体中，如食管这样以厘米计的假体，能长期保证其通畅度。

组织学上食管内衬复层鳞状上皮，从而提供了耐磨、抗腐蚀的内层。鳞状上皮细胞体外分离、培养已是成熟的方法，鳞状上皮细胞在体外分化能够形成多层上皮细胞。Odioso在接种有成纤维细胞的尼龙支架材料上复合接种牙龈鳞状上皮细胞，能形成分化良好的复层鳞状牙龈上皮。食管肌层为吞咽动作提供定向推动食团的动力系统。1997年Okano将肌原细胞与I型胶原混合后，注入不同的模型中形成了管状、盘状肌原细胞－胶原凝胶，发现肌原细胞能够在成型的胶原凝胶内进一步分化，有可能形成组织工程肌肉。

国内外有关消化道组织工程重建的研究尚在起步阶段，Choi与Kim等将小肠上皮细胞与高分子聚合物管状材料复合，体外三维培养形成小肠假体并移植、替代裸鼠缺损的肠管，假体与宿主相容性优良，通畅度好，但其最大不足就是上皮细胞与材料直接复合，没有构建消化动力系统。秦雄等采用海绵状胶原蛋白－壳聚糖膜作为支架材料，接种食管上皮细胞后移植于动物体内，移植2周后复层鳞状上皮细胞可达10层左右。

二、组织工程膀胱

因肿瘤、损伤等原因需进行的膀胱重建，是泌尿科面临的重要课题之一，所采用的天然及合成材料如小肠、Teflon等均存在着如结石形成、感染、异物反应等问题。

1．多聚物材料的应用　Atala在体外培养膀胱的上皮细胞及平滑肌细胞，并以抗角蛋白AE1／AE3及抗α肌动蛋白抗体证实其细胞特征，染色体检查证明培养细胞具有正常遗传特征。

进一步用PLLA作为动物体外膀胱移行上皮细胞的生长支架，并将体外培养的细胞－PLLA活性复合物移植于异种动物的膀胱缺损区获得成功，其用PLLA制成人工ECM支架，从实验兔的膀胱中提取移行上皮细胞，经过胶原酶及其他化学试剂处理后，此细胞种植于人工ECM支架上，再将细胞－PLLA复合物置于生长液中培养4d，移植于异种动物鼠的膀胱缺损区，观察到60d内兔的膀胱移行上皮仍然存活，随时间延长，PL－LA支架逐步降解吸收而为鼠自体膀胱的移行上皮及平滑肌细胞取代，实验证明，PLLA支架除起着支持兔的膀胱移行上皮生长外，还能对鼠的自体膀胱细胞再生修复起框架作用。Oberpenning以PLA及PGA共聚物塑形的膀胱作为支架，以狗的自体膀胱上皮细胞及平滑肌细胞体外培养扩增后种植于支架上并进行膀胱重建，结果表明，重建后的膀胱容量为术前的85%及110%，膀胱顺应性无变化，组织学检查证明组织工程化的膀胱形成如正常膀胱组织的结构，无感染、结石及梗阻等并发症，这一结果说明了以多聚体进行人膀胱重建的可行性。

2．天然ECM　是利用异种或异体哺乳动物机体ECM的重要天然成分。经特殊处理后，去掉组织中含抗原的细胞成分，而仅保留低抗原的ECM框架，根据需要可以将异体或异种的天然ECM框架移植于机体的缺损区，此ECM框架可作为自体组织细胞生长的框架，即依靠自体细胞的生长、繁殖，而使缺损组织的结构及功能得到修复。天然ECM的研究中以小肠黏膜下层（small　intestinal　submucosa，SIS）、膀胱黏膜下层（bladder　acellular　matrix　graft，BAMG）应用较多。①SIS：通过机械法分离去除小肠黏膜、浆膜、肌层，形成0．1mm厚主要以小肠黏膜下层为主的支架，行膀胱扩大。SIS含有活性内源生长因子、细胞素、结构蛋白、蛋白多糖。这些可以帮助细胞吸附、移动，使细胞之间形成连接，促进细胞生长分化，有利于组织的形成。以SIS进行替代的缺点是：小肠黏膜可以再生，且肠腔狭窄不易形成较大的腔，浆膜去除后会发生很大的收缩，影响扩大的效果。②BAMG：同种或异种膀胱的黏膜下层经过去免疫原性的处理形成细胞外基质网架，其优点是它是膀胱本身的自然的细胞外基质，网孔大小形态均适合膀胱黏膜细胞、平滑肌细胞的长入。其缺点是：网架制作过程复杂。

Zhang　Y等将培养的细胞以1×105／cm2的密度点状种植于小肠黏膜下层，孵育3、7、14和28d分别收获标本。有5种不同的培养方法：①将膀胱上皮细胞单独种植于小肠黏膜下层的黏膜表面；②将平滑肌细胞单独种植于黏膜表面；③将平滑肌细胞移植于黏膜表面后1h再将膀胱上皮细胞种植进行分层的联合培养；④将平滑肌细胞种植于浆膜表面24h后将膀胱上皮细胞种植于黏膜表面进行三明治样培养；⑤将膀胱上皮细胞和平滑肌细胞混合后种植于黏膜表面联合培养。在指定时间收获标本后用甲醛溶液固定，进行常规组织学分析，细胞形态、细胞增殖和分层、细胞排列、假复层尿路上皮的存在和基质的穿透。为区分联合培养中的平滑肌细胞和尿路上皮细胞，应用α－平滑肌肌动蛋白抗体和细胞角蛋白AE1／AE3进行了免疫组织化学分析。体外培养结果在小肠黏膜下层尿路上皮细胞和平滑肌细胞三维空间生长。单独尿路上皮和平滑肌细胞培养，细胞可以生长并分层，但没有或很少基质穿透。与此相比，分层培养、混合培养和三明治样培养中平滑肌细胞的膜穿透明显增加，分层的和三明治样培养技术导致有序的细胞排列、有规律的假复层尿路上皮的形成和多层的平滑肌基质穿透增加。混合细胞培养技术虽然使平滑肌细胞基质穿透作用明显，但没有使细胞有序排列。免疫组化研究证实尿路上皮和平滑肌细胞维持表型标记物的表达。因此小肠黏膜下层在体外支持人膀胱尿路上皮细胞的三维空间生长，采用不同的细胞种植技术进行联合培养，对将来在组织工程学中的应用非常重要。

James将异体犬的膀胱全切后，运用精确的显微外科技术将其黏膜及肌层分离，剥离出膀胱黏膜下层，将此黏膜下层用磷酸盐和其他化学试剂处理后，提取到异体犬膀胱黏膜下层的天然ECM框架。与此同时，将实验犬膀胱的平滑肌和移行上皮细胞置于含上皮生长因子的生长液中行体外培养，扩增后的两种细胞在体外培养成足够面积的片状后，将其分别紧贴于ECM的两面，继续在生长液中培养5d。用10只犬进行实验，所有犬的膀胱被切除50%，第1组5只犬的膀胱缺损区用贴有细胞的ECM修复，第2组用单纯的ECM修复，两组犬膀胱内均留置100ml水囊及行膀胱造瘘，14d后撤出水囊。术后2周时发现，第1组膀胱修复区黏膜和肌层存活良好，第2组膀胱修复区已有大量的黏膜和肌层，4周时两组动物的膀胱修复区均有完整的黏膜和肌层，组织学和免疫组化检查证实为类似于正常犬的膀胱移行上皮和平滑肌细胞，并在修复区发现了新生的神经纤维，12周时两组犬的膀胱外形已和正常膀胱无异，但两组实验犬的膀胱容量有所不同，第1组用贴附有细胞的ECM修复后的膀胱容量大于原膀胱；第2组膀胱容量稍小于原膀胱，两组之间膀胱黏膜下层的ECM在移植后会因宿主体内胶原酶的作用而发生降解，而第1组犬是由于贴附的细胞中ECM再生，维持了膀胱的网状结构，避免了ECM过早降解，使膀胱修复区自体细胞再生失去支撑框架，影响膀胱的容量。James的实验证实了异体膀胱ECM作为膀胱替代材料的可行性，1997年北京积水潭医院泌尿科应用异体兔膀胱ECM作为膀胱替代材料进行实验，其实验方法为：将20只实验兔于无菌下膀胱全切，所切膀胱固定于特定浓度的甲醛及戊二醛混合液中，对膀胱的ECM进行交联保护，之后利于低渗缓冲液，内含Tris，HCL及EDTA等对已固定的膀胱内细胞进行初次提取，再用RNA酶，DNA酶和一些化学制剂对膀胱内可引发宿主识别的细胞成分进行二次提取，得到将可引发免疫排斥反应的细胞成分消化掉的膀胱ECM，将此膀胱ECM框架作为膀胱替代材料，成功地移植于另20只兔的膀胱缺损区，经过自体膀胱细胞在此ECM框架上的生长、增殖，1个月后膀胱缺损区得到完整修复，在ECM区域已长满了类似正常兔膀胱的平滑肌细胞和移行上皮细胞。

三、组织工程输尿管研究

输尿管长段狭窄或缺损的外科治疗一直是临床上比较棘手的问题。理想的输尿管替代材料应具备如下标准：①与正常输尿管组织结构相近；②与宿主输尿管蠕动节律一致；③充足的血供；④无尿液渗漏，不被吸收；⑤不引起免疫反应；⑥无结石形成；⑦技术上简便可行；⑧吻合口处不易形成狭窄；⑨有正常神经再生及灵敏的药理学反应。既往临床上采用的修补材料很难满足此标准，而组织工程材料则较容易满足上述要求。

Dahams报道制备输尿管细胞外基质移植物（ureteral　acellular　matrix　graft，UAMG）的方法：取出大鼠的输尿管置于30ml 10mmol　PBS和0．1%叠氮钠（sodium　azide）的混合溶液中浸泡搅拌过夜；遗留的基底膜和细胞继续用上述溶液浸泡搅拌5～6h，使得部分细胞裂解；经PBS漂洗后，用50ml 1mol　NaCl加2　000kU　DNase搅拌6～8h。此时，细胞完全裂解，细胞内成分释放；标本用4%脱氧胆酸钠和1%叠氮钠浸泡和搅拌5～6h，以溶解细胞膜及细胞内的膜脂质。这一过程必要时需重复一次。获得的材料行光镜HE染色及扫描电镜检查。由此制备的UAMG具有以下特点：①基本无排斥反应。组织中细胞及其分泌的各种蛋白是产生抗原性的主要原因，单纯ECM抗原性极低。因此单独ECM或与培养的自体细胞结合的ECM均表现出极低的抗原性，在已进行的ECM的实验中浸润的炎性细胞均低于移植物范围的10%。术前术后的淋巴细胞毒试验也无显著性差异。②可基本恢复输尿管的组织结构及生理功能。由于ECM结构与被替代组织结构相似，富含胶原、弹性纤维，又含有许多促进细胞吸附、铺展、启动修复、增殖的生物大分子，如RGD序列（精氨酸—甘氨酸—门冬氨酸序列），可以保证新生组织按原有结构生长，并伴随新生血管神经的长入。这些都保证了再生组织功能的恢复。这对于保证输尿管蠕动功能的重建及防止替换部位狭窄及结石形成亦具有重要意义。③无结缔组织包裹，可实现永久性植入。人工材料植入后结缔组织会对其进行包裹，使植入物体积缩小，正常组织无法长入、发生感染、结石形成、术后器官功能丧失等。

用该方法制备的UAMG进行输尿管替代，研究发现1周时ECM边缘腔内面已见移行上皮细胞，管壁有肌细胞长入。6周时ECM区已修复至近正常输尿管组织结构。12周后可观察到神经组织再生，尽管数量上明显少于正常，但形态正常，4个月后明显增多。3周后的血尿常规及血生化正常，淋巴细胞毒实验与术前无显著性差异。12、24周行IVU检查，输尿管显影通畅良好，未见结石形成。应用RT－PCR对术后各种生长因子进行了检测，发现转移生长因子IGF，特别是IGFα和IGFβ－1可能对控制上皮化的过程起关键性作用。

人工聚合材料也可用作组织工程输尿管构建的支架材料。Alata等用病检或手术中取出的泌尿系组织细胞在体外培养扩增后种植于生物可降解的管状聚合物（PLA或PGA）上，再混合培养4～5d后种植于裸鼠皮下，术后5d组织学检查出现新生血管，术后20d聚合物纤维出现降解，50d后可见多层片状平滑肌及上皮组织形成。

蠕动是输尿管的重要生理功能，也是尿液顺利排入膀胱、防止膀胱输尿管反流的重要保证。因此，组织工程化组织替代输尿管缺损是否完全履行输尿管的蠕动功能仍为人们所关注的问题，特别是对输尿管平滑肌及神经纤维再生的规律及调控其再生的各种因素及各因素作用机制的研究有待进一步深入。

虽然组织工程材料特别是天然细胞外基质在引导组织再生方面效果非常明显，但其分子机制仍有待研究。如已知大量细胞因子对组织再生作用明显，但其作用方式、量效关系、调节网络等均不清楚。Sievert在研究ECM引导兔尿道再生的过程中发现正常组织与再生组织中TGFβmRNA的表达没有明显差异；与此同时，肝素相关上皮生长因子（heparin－binding　epidermal　growth　factor，HB－EGF）在植入10d后大量表达，正常组织中没有。作者认为HB－EGF对于再生尿道组织的血管化及促进再生有重要作用。其次，对于如何促进再生组织中新生血管形成，也成为学者们关注的焦点。由于通过渗透等方式进行营养物质的供应不能从根本上解决组织对代谢的要求，所以新生血管的形成是组织能否再生与维系的关键。许多细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）、TGFβ及血管促血细胞生成素（Ang　angiopoietins）等均被认为与血管化（vasculogenesis）及新生血管形成（angiogenesis）有关。再次，各种材料特别是天然材料表面的各种分子，如各种黏附分子、糖蛋白等的研究尚须进一步深入。

一般而言，对于天然ECM材料，由于在制备过程中对组织结构的损伤，残留成分往往因强度不够或降解过快，无法在一定的时间内保证其机械学性能，必须进行相应处理。如输尿管组织完全再生、新生基质完全替代植入物须4个月时间，这对起支架作用的材料提出了较高的要求。对天然ECM进行交联保护是目前常用的做法。交联是指胶原分子内部和胶原分子之间通过共价键结合实现提高胶原纤维张力和稳定性的目的，主要涉及胶原中的赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸等残基。目前通常采用物理或化学方法来达到这一目的，而既能达到保护目的又对细胞无毒性作用的方法还有待研究。对于人造聚合材料及天然材料的生物相容性、内部结构、表面性质及表面结构等的改造将有效地提高细胞在材料上的黏附能力；通过细胞因子的作用，可改善材料引导新生血管形成或使组织血管化；通过材料内部结构的改造，使材料的降解速度与组织发育速度一致等等课题都将成为组织工程材料研究领域中的热点。

（四川大学华西医院　谢慧琪）

参　考　文　献

1　岑石强，杨志明 ．肌原细胞在基因治疗和组织工程中的应用综述 ．中国修复重建外科杂志，1999；13（3）：173－177

2Kaplan　JC，Fontaine　B．Neuromuscular　disorders：gene　location．Neuromusc　Disord，1997；7：Ⅰ－Ⅺ

3Partridge　TA，Morgan　JE，Coulton　GR，et　al．Conversion　of　mdx　myofibres　from　dystrophinnegative　to　positive　by　injection　of　normal　myoblasts．Nature，1989；337：176－179

4Gussoni　E，Pavlath　GK，Lanctot　AM，et　al．Normal　dystrophin　transcripts　detected　in　Duchenne　muscular　dystrophy　patients　after　myoblast transplantation．Nature，1992；356：435－438

5Coovert　DD，Burghes　AHM．Gene　therapy　for muscle　diseases．Current　Opinion　in　Neurol，1994；7：463－470

6Dubowitz　V．Utrophin　euphoria．Neuromusc Disord，1997；7：5－6

7　刘　霞，王常勇，范　明 ．心肌组织工程研究进展．中国康复理论与实践，2002；8（5）：283－285

8Dorfman　J，Duong　M，Zibaitis　A，et　al．Myocardial　tissue　engineering　with　autologous　myoblast　implantation．J　Thorac　Cardiovasc　Surg， 1998；116：744－751

9Taylor　DA．Atkins　BZ，Hungspreugs　P，et　al．Regenerating　functional　myocardium：improved performance　after　skeletal　myoblast　transplantation．Nat　Med，1998；4：929－933

10Soonpaa　MH，Koh　GY，Klug　MG，et　al．Formation　of　nascent　intercalated　disks　between grafted　fetal　cardiomyocytes　and　host　myocardium．Science，1994；264：98－101

11Li　RK，Jia　ZQ，Weisel　RD，et　al．Cardiomyocyte　transplantation　improves　heart　function．Ann　Thorac　Surg，1996；62：654－661

12Reinecke　H，Zhang　M，Bartosek　T，et　al．Survival　integration　and　differentation　of　cardiomyocyte　grafts：a　study　in　normal　and　injured　rat hearts．Circulation，1999；100：193－202

13Lattanzi　L，Salvatori　G，Coletta　M，et　al．High efficiency　myogenic　conversion　of　human　fibroblasts　by　adenoviral　vector－mediated　MyoD　gene transfer．An　alternative　strategy　for　ex　vivo gene　therapy　of　primary　myopathies．J　Clin　Invest　1998；101：2119－2128

14Makino　S，Fukuda　K，Miyoshi　S，et　al．Cardiomyocytes　can　be　generated　from　marrow　stromal cells　in　vitro．J　Clin　Invest，1999；103：697－705

15Wang　JS，Shum－Tim　D，G　alipeau　J，et　al．Marrow　stromal　cells　for　cellular　cardiomyoplasty：feasibility　and　potential　clinical　advantages．J　Thorac　Cardiovasc　Surg，2000；120：999－1005

16Li　RK，Weisel　RD，Mickle　DA，et　al．Autologous　porcine　heart　cell　transplantation　improved heart　function　after　a　myocardial　infarction．J Thorac　Cardiovasc　Surg，2000；119：62－68

17Yokomuro　H，Li　KR，Mickle　DA，et　al．Transplantation　of　cryopreserved　cardiomyocytes．J　Thorac　Cardiovasc　Surg，2001；121：98－107

18Li　Rk，Yau　TM，Weisel　RD，et　al．Construction　of　a　bioengineered　cardiac　graft．J　Thorac Cardiovasc　Surg，2000；119：368－375

19Freed　LE，Vunjak－Novakovic　G．Microgravity tissue　engineering．In　Vitro　Cell　Dev　Biol　Anim，1997；33：381－385

20Carrier　RL，Papdaki　M，Rupnick　M，et　al．Cardiac　tissue　engineering：cell　seeding，cultivation　parameters，and　tissue　construct　characterization．Biotech　Bioeng，1999；64（5）：580－589

21 秦　雄，徐志飞，史宏灿，等 ．组织工程构建人工食管的初步实验研究。第二军医大学学报，2002；23（10）：1134－1137

22Takimoto　Y，Nakamura　T，Yamamoto　Y，et al．The　experimental　replacement　of　a　cervical esophageal　segment　with　an　artificial　prosthesis with　the　use　of　collagen　matrix　and　a　silicone stent．J　Thorac　Cardiovasc　Surg，1998：116（1）：98－106

23Sato　M，Ando　N，Ozawa　S，et　al．An　artificial esophagus　consisting　of　cultured　human　esophageal　epithelial　cells，polyglycolic　acid　mesh，and collagen．ASAIO　J，1994；40（3）：M389－392

24Butler　CE，Orgill　DP，Yannas　IV，et　al．Effect of　keratinocyte　seeding　of　collagen－glycosaminoglycan　membranes　on　the　regeneration　of　skin in　a　porcine　model．Plast　Reconstr　Surg，1998；101（6）：1572－1579

25 刘　流，梁德江 ．组织工程学材料作为膀胱替代材料的研究和应用 ．国外医学·泌尿系统分册，1999；19（4）：145－147

26 宋　超，杨嗣星，王玲珑 ．组织工程材料替代输尿管缺损的研究进展 ．国外医学·泌尿系统分册，2002；22（5）：263－266