喉软骨缺损治疗的难题主要是移植软骨的来源与理想植入的方法学问题。软骨组织工程以其能再造具有相应功能和形态的软骨组织并能原位或移位构建再移植的技术优势给喉软骨缺损的修复与功能重建提供了崭新的治疗手段。目前软骨组织工程已取得许多令人鼓舞的研究成果。但是，由于喉软骨形态、部位和功能的特殊性，迄今用组织工程技术尚未构建出喉软骨组织，这不仅因为当前像喉这样大块有形化组织工程软骨的构建对种子细胞数量和生物材料的塑形要求较高，而且其不规则的中空三维形态也是组织工程方法构建的难点。
鉴于传统方法治疗喉软骨缺损存在许多不足和软骨组织工程技术所展示出的诱人应用前景，我们在既往有关喉、气管软骨组织工程研究的基础上，通过进一步改良同种异体软骨细胞收集环节，尝试应用新型生物材料聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物聚羟基烷酸酯类［poly（3－hydroxybutyrate－co－3－hydroxyhexanoate，PHBHH）］来探索喉组织工程化软骨的构建方法，以期实现大块有形化实用化组织工程喉软骨构建的突破，为今后构建组织工程化喉复合组织奠定基础。
一、材料与方法
（一）主要仪器、试剂和材料
倒置相差显微镜，CO2培养箱，DMEM／Ham－F12培养基，Ⅱ型胶原酶，多聚赖氨酸（Mr：18．9万），聚羟基丁酸酯与聚羟基己酸酯共聚物［p（3HB－co－3HH），PHBHH］，胎牛血清（Fatal bovine serum，FBS），胰蛋白酶，新西兰白兔乳兔和成兔，Ⅱ型胶原免疫组织化学试剂盒。
（二）方 法
1．软骨种子细胞获取 1周龄新西兰白兔乳兔，雌雄不限，无菌条件下取其肋软骨和关节软骨，去净软骨膜，0．1mol／L灭菌磷酸缓冲液（0．1mol／L PBS，含青霉素、链霉素各200U／ml）冲洗2遍，0．25%胰蛋白酶先消化2min，PBS冲洗3遍；然后剪切成1～2mm3左右碎块，PBS再浸洗一遍；置50ml小烧杯中，加0．3%Ⅱ型胶原酶，37℃搅拌消化，自1h起，每0．5h收集细胞1次，直到全部固体物消失。所获细胞悬液，1 000r／min离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗2遍；DMEM／Ham－F12（1∶1）混合培养液（含20%FBS）重悬细胞，苔盼蓝染色，细胞计数板（血细胞计数板）法计数（染色细胞判为失活力细胞，拒染细胞为活力细胞）。以2×105／ml浓度接种于100ml培养瓶内，48h换液1次，细胞贴满壁后传代。传代时0．25%胰蛋白酶几乎分离贴壁细胞后继续作用3～5min，收集第3代培养软骨细胞，离心后制成细胞悬液，再次苔盼蓝染色检查细胞活力。
2．生物材料塑形
（1）模具制备：以成年人全喉软骨形态为塑形参照，按3∶1缩小制备出塑钢模型。以聚四氟乙烯为模具材料，雕刻出相应形态的阴模，模具由一个内芯和两块外板组成（图17－14，彩图80）。
图17－14 用于制备喉形态生物材料塑形物的模具组成与外观
（2）材料塑形：采用溶液浇铸、模压成形和颗粒滤沥方法制备具有喉软骨形态的生物支架材料塑形物。具体方法：在球形玻璃容器中按一定比例加入PHBHH絮状材料和氯仿溶剂，密封条件下加热回流，充分搅拌，待溶液成均匀的稀糊状后，迅速倒入盛有氯化钠盐粒（筛分为100～150μum）的广口瓶内，密封瓶口，室温下过夜（使材料自然渗入盐层内）。取材料与盐的混合物先制备成片状，然后包裹模具芯部，再左右合拢外模，金属夹具固定，液压成形。脱模样品置通风橱中至少48h，使氯仿充分蒸发。然后放入真空抽滤器中抽滤12h以除去可能残留的氯仿。所得样品置一金属网内，悬于盛三蒸水的玻璃容器内，磁力搅拌，滤沥除盐，三蒸水至少更换3次。除去盐粒的样品自然干燥后用液体（乙醇）静态容积测量法测定其孔隙率。
（3）材料处理：喉形态支架材料塑形物用相应形态医用钢丝内面助塑，用时以75%乙醇浸泡消毒，大量PBS漂洗至少3遍，无菌环境下干燥，无菌多聚赖氨酸溶液浸1h，干燥后备用。
3．软骨细胞与PHBHH复合 调整软骨细胞悬液为5×107个／ml，分别接种于经培养液预湿后约七成干燥的塑形材料上（每次操作n＝3），接种时每次少量吸取细胞悬液，多点播散，尽可能使细胞分布均匀，塑形材料中空的内面以弯头吸管接种细胞。细胞与材料复合后置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育0．5h后取出，调整塑形材料的上下放置状态，将围绕材料底部的细胞悬液吸出再次自上而下接种，反复2次后，静止孵育1h，再加入新鲜培养液，加入量以浸润复合物1cm以上为宜。以后每48h换液1次，倒置显微镜下观察复合物边缘细胞生长及附着情况。将上述负载软骨细胞的塑形材料设为实验组，另设空白对照组，除塑形PHBHH材料上不加软骨细胞（每次操作n＝1）外，其余处理同实验组。除此之外，将每批与实验组处理相同的5mm×5mm片状复合物用2．5%戊二醛固定，逐级乙醇脱水、干燥、黏托、离子浅射喷金后扫描电镜观察。
4．负载软骨细胞的PHBHH体内植入24只4～6月龄雄性新西兰白兔，体重2．5 ±0．5kg，分段随机分组法分成两批进行手术操作，每批12只，每批再次分段随机分组法随机分成实验组（9只）和对照组（3只）。戊巴比妥30mg／kg体重，耳缘静脉全麻，将体外培养1周负载软骨组织的PHBHH塑形材料植入体内。其中以大网膜充填与包裹方法植入兔腹内（图17－15，彩图81）的操作定为第一批；以分离兔脊背后部一侧骶棘肌和筋膜瓣、肌肉与筋膜瓣共同包裹方法植入兔背脊一侧肌肉与皮下组织间（图17－16，彩图82）的操作定为第二批，每批手术操作均由同一组人员实施，操作过程和技术步骤保持一致。术后静脉注入青霉素80万U，以后隔日肌注青霉素80万U，共4次。
图17－15 大网膜充填与包裹方法腹内植入喉形态生物材料塑形物
图17－16 肌肉与筋膜瓣共同包裹方法背脊一侧肌肉与皮下组织间植入负载软骨细胞的喉形态生物材料塑形物
5．实验观察 分别于术后6周、12周和18周取材（每个时间点每批实验组取材3只，对照组1只），观察喉组织工程化软骨形成的大体形态，并进行HE染色、Masson三色染色、阿丽新蓝过碘酸雪夫反应（Alcian blue－periodic acid Schiff reaction，AB－PAS）染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检查，对软骨形成情况作出评价。
【附】 Ⅱ型胶原免疫组织化学检测技术
Ⅱ型胶原是透明软骨基质的特异性标志，在软骨基质检出Ⅱ型胶原的存在，说明软骨为透明软骨。喉软骨属于透明软骨，组织工程技术构建出的喉软骨是否也属于透明软骨性质，须经免疫组织化学检测确定。目前免疫组织化学技术发展很快，包括免疫荧光细胞化学、免疫酶细胞化学、免疫金银及铁标记组织化学和亲和组织化学等技术在科研和医疗等方面均得到普遍应用。其中亲和组织化学技术以其敏感度高、特异性强、操作简便和背景清晰等特点在软骨基质Ⅱ型胶原检测中显示出独特的优势。本章Ⅱ型胶原免疫组织化学检测方法是基于亲和组织化学技术的原理，因此，这里注重介绍亲和组织化学技术。
亲和组织化学技术又称生物素（biotin）－亲和素（avidin）化学技术，是基于生物素与亲和素具有高度的特异亲和能力而发展起来的一项类似免疫（抗原－抗体结合）组织化学技术。亲和素亦称抗生物素，是一种碱性蛋白，由4个相同亚基组成的大分子糖蛋白，分子量为68kD，可直接耦联各种标记物如酶、核素等，特别是与生物素具有高度亲和力，较抗原抗体的结合力高出约100万倍，因此这种结合物更稳定，不易解离，但牢固的结合并不影响彼此的生物学活性。生物素（亦称维生素H）是一种结构简单的小分子，分子量仅为244，它也具有与其他示踪物结合的能力。将两种物质应用到亲和组织化学称为生物素－亲和素系统（biotin avidin system，BAS）。在这一系统中根据两者标记物和彼此结合位点的不同又分为三项应用技术。
一、亲和素－生物素－过氧化物酶技术（avidin biotin－peroxidase complex technique，简称ABC技术）
ABC技术是将亲和素作为“桥”，把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，与下述LAB法和BRAB法不同的是第一抗体不为标记物所标记，生物素标记的第二抗体与第一抗体反应后，再与ABC复合物相连接（所谓复合物是将生物素化的过氧化酶与过量的亲和素结合），最后进行呈色反应。在这个系统中一个分子的亲和素有4个结合位点，可以分别和生物素化的抗体和生物素化的酶结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白分子又可结合多个生物素分子，从而形成网络状复合物，同时ABC复合物的分子量较小，易于渗透，又大大增加了此技术的敏感性。由于操作时第一抗体及第二抗体可高倍稀释，减少了背景着色的可能性，能最大限度避免非特异性着色。其中从链霉菌中提取的一种亲和素称为链霉亲和素（streptavidin，SA），SA的等电点接近中性（pH6．0～6．5），对组织和细胞的非特异吸附极低，因而基于SA 的生物素－亲和素（streptavidin－biotin complex technique，SABC）免疫组织化学方法的染色背景更低。SABC可形成100个左右的过氧化物酶和50个左右的SA所构成的复合物，大量的酶能保证SABC具有更高的敏感性。因而SABC具有更高的敏感性和更低的背景着色性。
【ABC技术操作步骤】
（1）冷冻及石蜡切片均可，冷冻切片用丙酮固定10min左右，0．01mol／L PBS（pH 7．2）洗5min，更换3次；石蜡切片二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水；
（2）加第一抗体（如鼠抗羊等），37℃孵育45min或4℃过夜；
（3）PBS洗5min，更换3次；
（4）加生物素标记的第二抗体（如biotin－羊抗鼠等，1∶200左右稀释），37℃孵育45min；
（5）PBS洗5min，更换3次；
（6）加1∶100ABC复合物（使用前0．5h将等量的亲和素和酶标生物素混合，稀释配制成ABC复合物），37℃作用45min；
（7）PBS洗5min，更换3次；
（8）0．05%二氨基联苯胺（DAB），0．03%过氧化氢（H2O2）溶液显色；
（9）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
【阳性结果】Ⅱ型胶原所在部位呈黄褐色。
二、标记生物素－亲和素技术（Labelled avidin biotin technique，LAB技术）
LAB技术是以生物素标记的抗体做第一抗体，酶标记亲和素作为第二抗体。
【LAB技术操作步骤】
（1）冷冻及石蜡切片均可，冷冻切片用丙酮固定10min左右，0．01mol／L PBS（pH 7．2）洗5min，更换3次；石蜡切片二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水；
（2）PBS洗5min，更换3次；
（3）室温下用1∶100生物素标记的第一抗体（PBS液稀释）孵育1h。
（4）PBS洗2次，每次5min；
（5）用1∶200过氧化物酶标记的亲和素孵育45min；
（6）PBS洗5min，更换3次；
（7）0．05%二氨基联苯胺（DAB），0．03%过氧化氢（H2O2）溶液显色；
（8）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
【阳性结果】Ⅱ型胶原所在部位呈黄褐色。
三、桥联亲和素一生物素技术（Bridged avidin biotin technique，BRAB技术）
BRAB技术是用生物素分别标记抗体和酶，然后以亲和素为桥。把两者连接起来，检查抗原时，先用生物素标记的抗体与细胞（或组织）的抗原反应，洗去未结合的抗体，加入亲和素孵育后，洗去未结合的亲和素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，最后呈色反应。
【BRAB技术操作步骤】
（1）冷冻及石蜡切片均可，冷冻切片用丙酮固定10min左右，0．01mol／L PBS（pH 7．2）洗5min，更换3次；石蜡切片二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水；
（2）PBS洗5min，更换3次；
（3）加生物素标记的第一抗体，37℃孵育45min；
（4）PBS洗5min，更换3次；
（5）加亲和素，37℃孵育45min；
（6）PBS洗5min，更换3次；
（7）加标记酶的生物素，37℃孵育45min；
（8）PBS洗5min，更换3次；
（9）0．05%二氨基联苯胺（DAB），0．03%过氧化氢（H2O2）溶液显色；
（10）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
【阳性结果】 Ⅱ型胶原所在部位呈黄褐色。
（1）软骨细胞活力测定：调整胰蛋白酶作用程度后所获软骨细胞活力为（93±2）%，一般操作所获软骨细胞活力为（94±2）%，两者相比P＞0．05。
（2）PHBHH材料塑形：经模压成形为喉软骨形态的PHBHH材料外观呈中空半面喇叭状，棱角分明，形态逼真，滤沥除盐后整体结构呈海绵状，液体（乙醇）静态容积测量法测得其孔隙率＞90%，孔径100～150μm，厚度1．5mm左右（图17－17，彩图83）。
图17－17 制备出的喉形态生物材料（PHBHH）塑形物
（3）负载软骨细胞的PHBHH：体外培养观察接种细胞后24h，倒置显微镜下边缘观察见细胞附于材料表面。第2次换液时肉眼下即可见材料表面有薄层透明胶冻状物均匀分布。培养1周胶冻样物质明显增多。扫描电镜观察：细胞密布材料表面及其海绵状空隙内，呈单个或簇状分布，周围有基质分泌（图17－18）。
（4）大体观察：术后所有动物成活良好。体内植入6周取材，第1批植入物外包裹的大网膜密布血管，切开外裹大网膜，见中空部
图17－18 负载软骨细胞的喉形态PHBHH扫描电镜观察A×1 000，B×5 000
分植入的网膜与外裹网膜色泽一致，两端粘连成一体，血管较密。剥去外裹网膜，见喉形态植入物外形与植入前基本一致，2个样本表面呈乳白色，光滑，具有一定硬度，另一样本色灰黑状，质软。取出中间部网膜组织及助塑钢丝。质软的样品不能成形，塌陷，局部有呈“豆腐渣”样物积聚；其余2个标本形态逼真，有撑力。对照组塑形物材料已大部分消失，助塑钢丝周围留有少许淡黄色残渣物。第2批植入物外面包裹的筋膜与皮下结缔组织和肌肉粘连成一体，结缔组织上密布细小血管，剥去部分包裹的组织见中空部分填充的肌肉与植入物接触紧密。有2个植入物稍有不对称变形，另一植入物形态与植入前一致。去除包裹及充填组织，得到3个完整的，有一定硬度和支撑力的标本，其中2个形态稍有改变，主要是相当于甲状软骨翼板的喉形态塑形物上口有卷折，失去理想的对称性，但依然保持喉软骨形态外观。3个标本内外表面光滑，呈乳白色。对照组未成形。12周时，实验组每批各收获2个完整标本，形态逼真，瓷白色（图17－19，彩图84）。18周时实验组每批仍各收获2个完整标本，与12周色泽基本一致。对照组均未收获完整标本，无软骨样组织形成。
图17－19 A第一批体内植入12周时获取的喉形态组织工程化软骨大体标本，B第二批体内植入12周时获取的喉形态组织工程化软骨大体标本（箭头所指为PHBHH材料塑形物）
（5）组织学观察
①HE染色：6周获取的组织工程化软骨组织，镜下见典型软骨组织结构，软骨细胞形态呈圆形，椭圆形或多角形，细胞多呈单个散在分布，少量可见陷窝。细胞间有“杂质”（PHBHH不全降解吸收）（图17－20，彩图85）；12周时：软骨细胞形态多呈椭圆形，常见2～3细胞簇状分布，细胞陷窝多见，间质均染；18周时：所见与12周基本相同。腹内植入与背部植入获取的软骨组织HE染色表现基本一致。对照组未见软骨细胞存在。
图17－20 6周时喉形态组织工程化软骨，HE染色
×200
②Masson三色染色：6周时，实验组软骨细胞细胞质及软骨基质中可见淡绿染物，（图17－21，彩图86）；12周时细胞细胞质及软骨基质中绿染物增多，染色明显加深；18周时，细胞形态，分布及着色与12周时无明显差别。12周时对照组因无定形物，无法取材染色。
③AB－PAS染色：6周时，基质呈淡紫色，12周及18周时呈紫色（图17－22，彩图87）。
（6）Ⅱ型胶原免疫组织化学检测：6周时呈弱阳性，主要分布于细胞细胞质，基质中几乎检不出阳性物；12周时细胞细胞质中阳性物明显增强，基质中检出Ⅱ型胶原阳性物；18周时与12周时着色基本一致（图17－23，彩图88）。
图17－21 6周时喉形态组织工程化软骨，Masson三色染色×400
图17－22 18周时喉形态组织工程化软骨，AB－ PAS染色×200
二、实 验 评 价
喉支架软骨受损，不仅失去外形美观，而且严重影响生活质量。软骨组织工程技术为理想修复喉软骨缺损带来了希望，但由于喉软骨形态的特殊性，迄今用组织工程技术尚未再造出喉支架软骨组织。
喉支架软骨构建的难点在于其形态属大块有形化和中空不规则结构状软骨框架，在构建过程中不仅需要更多的软骨种子细胞和更高的生物材料塑形技术，而且利于软骨再生和形态维持的体内植入方法也是尚需克服的关键技术。
自体软骨细胞是软骨组织工程首选种子细胞，可惜来源受限，体外培养“去分化”现象又难以克服。因此，目前条件下不易从少量自体软骨获取大量具有正常功能的软骨种子细胞。虽然从“干细胞”获取软骨细胞已有初步研究，但这些技术尚处于萌芽阶段，实现产业化生产还很遥远。
软骨内无血管、淋巴管和神经，细胞被包埋在由软骨基质形成的软骨囊内，因此软骨细胞具有抗原性弱，不易被机体免疫系统攻击的特点，而且作为种子细胞，在获取过程中经过酶的消化、传代培养和与生物材料的复合培养等系列处理，细胞表面抗原可进一步削弱和包裹。软骨的这些免疫学优势使得同种异体软骨细胞作为组织工程种子细胞成为可能。迄今用成体和胚胎来源的同种异体软骨细胞在具有免疫力的多种动物体内均已构建出组织工程化软骨组织，研究提示胚胎来源的同种异体软骨细胞是组织工程种子细胞的优先选择。
本实验取出生3d内幼兔软骨作为种子细胞来源，通过改良软骨细胞传代培养过程中胰蛋白酶的消化程度，期望能进一步削弱细胞的免疫原性。结果表明获取的细胞活性和功能均未受到影响，在成兔体内成软骨能力良好，未出现明显炎性反应。
在软骨组织工程生物材料研究中，目前包括人工合成和天然类等多种材料都有尝试用于组织工程化软骨组织构建的报道，以形成片状和无中空结构的简单形态组织工程化软骨为主，尚无适宜大块中空形态软骨组织构建需求的生物材料，且普遍存在价格昂贵、加工工艺复杂等问题。因此，继续探索理想的软骨组织工程生物支架材料研究仍是面临的课题。
聚羟基烷酸酯类材料（PHA）是由微生物产生的聚酯，具有高熔点、高结晶度、高分子量、耐拉伸和生物相容性良好、无致炎性、无排斥性和易降解等特点。微生物制造的PHA产品完全不含有人工合成生物材料可能残留的有害物质，是极洁净的生物材料之一，其体内最终产物是CO2和水。作为一种新型生物材料，在医学领域已展露出广阔的应用前景。研究表明，PHA系列聚合物中，随着单体碳数的增加，力学性能存在着从脆性到黏性的转变。由于该系列聚合物种类较多，且聚合物之间有较好的相容性，通过对不同聚合物的优势组合，可以得到具有更佳强度、韧性、生物相容性和可控降解性的组织工程支架材料。
基于PHA类聚合物的性能优势，本研究采用由聚羟基丁酸酯（PHB）与聚羟基己酸酯（PHHX）共聚而成的优化材料——PHBHH。此材料是目前惟一的一种具有我国自主知识产权的组织工程生物材料产品，不但具有PHA类材料的优点，而且价格低廉、来源充裕，是一种质优经济的生物材料，已有应用于软骨组织工程研究的报道。实验中，我们采用溶液浇铸、模压成形和滤沥除盐方法制备的PHBHH喉形态支架材料，经简单的表面修饰即用于软骨组织的构建，显示出作为喉形态组织工程塑形材料的良好性能。
组织工程技术的优势之一是预构组织或器官的结构和形态。喉支架软骨形态不规则，且呈中空喇叭状，是组织工程技术构建的难点。在软骨组织工程研究中，虽然有成功构建“环形”和“C”形组织工程化软骨的报道，但其材料塑形与构建方法难以适应像喉支架这样复杂形态软骨的构建需求。如何使负载了软骨种子细胞、具有中空三维立体结构的喉形态塑形物在体内植入时，各个层面均与受区组织充分接触，以利于种子细胞获取营养和新陈代谢以及生物材料的降解吸收是成功形成组织工程化喉软骨的前提。
大网膜血运丰富，游离度高，有足够的活动度和折叠度，可根据需要分成若干部分使用，在临床上常用于组织缺损的修复与包裹材料，也有可能适宜组织工程化喉软骨构建的需要。因此，我们的实验首先从用大网膜充填与包裹入手来尝试构建组织工程化喉形态软骨。结果表明，以这一方法形成的组织工程化喉软骨，不但能维持喉支架软骨构建的大体形态，而且成软骨效应理想，说明大网膜充填与包裹和腹腔环境有利于组织工程化喉软骨的形成与塑形，是特殊形态组织工程化软骨构建行之有效的植入方法。但是，这一技术损伤较大，须二次开腹，不利于临床应用。
受筋膜瓣包裹技术在骨和软骨组织工程应用的启发，以有血供筋膜瓣和肌肉组织作为喉形态塑形物中空部分的填充物和外周包裹组织也有可能在动物皮下构建出像喉支架软骨这样复杂形态的组织工程化软骨组织。实验中首先分离出相应大小类似“圆锥体形”的中空部分肌肉填充瓣，发现不但肌肉瓣血运不受影响，掀起瓣后留下的“坑”可容纳大部分塑形物，而且移植床血运丰富，塑形物位于“坑”中，内有筋膜衬里与肌肉充填，外有“坑壁”支持，自塑形物直径小的一端固定肌肉瓣后，负载了软骨细胞的喉形态塑形物大部分可牢固地固定于肌肉组织中，其上部仅需少量的筋膜瓣组织就可有效地包裹。用此方法构建出的喉形态组织工程化软骨与大网膜包裹腹内成形术获取的喉形态组织工程化软骨在大体形态和组织学上几乎具有同样的效果。证明用筋膜瓣和肌肉共同包裹与充填的植入方法在合适的机体表面同样能形成组织工程化喉形态软骨。这一植入方法为组织工程喉形态支架软骨的临床应用提供了简便可行的途径。对局部软组织充裕的患者，我们可以直接用颈部肌肉与筋膜瓣作为包裹和充填组织在喉位置附近形成相应大小和形态的喉软骨组织，然后就近转移修复喉软骨缺损，重建喉功能；对局部软组织缺乏者可以用远离喉部的肌肉及筋膜组织先构建相应大小和形态的喉软骨组织，再通过带蒂肌瓣远处转移，或应用显微外科游离转移技术将工程化软骨组织连同包裹的软组织一并移植，同样能达到修复重建目的。
应用这一技术对中空植入体不但能保障充分的血运，而且衬以内面的薄层筋膜组织又有上皮化倾向，既有利于组织工程化软骨的成功移植，又有利于移植软骨内面的上皮化，是一种较为理想的喉形态组织工程化软骨组织构建与应用技术。
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