实验方法选择的目的在于选择一个既符合本实验室自身条件,又有较好的性能特点,且适合于临床的方法。
(一)实验方法和参考物质的分级
1.实验方法的分级 实验方法(即测量方法)产生测量程序。根据分析方法的准确性与精密度不同,国际临床化学联合会(International Federation of Clinical Chemistry,IFCC)将其分为决定性方法、参考方法和常规方法三级,ISO 15189文件又将其具体细化为相应的一个或多个测量程序。
(1)决定性方法(definitive method):准确度最高,系统误差最小,经过详细研究,没有发现产生误差的原因,用该法测得的结果与“真值”最为接近。由于该方法技术要求太高,费用昂贵,因此不能直接用于鉴定常规方法的准确性,只用于评价参考方法与一级校准品。国际上研究该类方法的实验室很少,主要在美国、法国、德国和丹麦等。主要方法有重量分析法、中子活化法、核素稀释-质谱分析法(ID-MS)等。
决定性方法的测量原理等同于ISO的一级测量原理,其产生的测量程序称为一级参考测量程序,是具有最高计量学特征的参考测量程序,主要由国家计量机构建立,其操作可被完全描述和理解,所有的不确定度可用SI单位表示。一级参考测量程序为一级校准品定值。
(2)参考方法(reference method):准确度与精密度已被充分证实,且经公认的权威机构(包括国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等)颁布的方法。这类方法干扰因素少,系统误差很小,并且有适当的灵敏度、特异性,以及较宽的分析范围和良好的线性,重复测定中的随机误差可忽略不计。参考方法又分为公认的参考方法和推荐的参考方法两类,能在条件优越的实验室作常规分析。主要用途有:①鉴定常规方法,评价误差大小、干扰因素,并决定是否可以被接受;②鉴定二级校准品、为质控物定值;③评价商品试剂盒的质量;④产生二级参考测量程序。
按照参考方法的测量原理建立的测量程序称为二级参考测量程序,该测量程序需用一级校准品校准,具有较高的特异性和精密度,适合于复杂生物样本的分析,在临床检验领域发挥主要作用。参考方法又可以产生出厂家选定测量程序和常务测量程序、用户常规测量程序等多个测量程序,其中前两个程序为厂家工作校准物、厂家产品校准物定值。
(3)常规方法(routine method):性能指标符合临床或其他目的的需要,具有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围,且经济实用的实验方法。是目前临床实验室的常规分析方法,应用最为广泛。根据准确度的确定与否分为偏差已知的常规方法和偏差未知的常规方法两种。常规方法在作出评定以后,经有关学术组织认可,可以作为推荐方法。
与常规方法的测量原理相对应的程序是用户常规测量程序,但部分用户即参考实验室可采用参考测量程序测量样本。
临床生化检验部分项目的决定性方法、参考方法和常规方法见表2-1。
表2-1 临床生化检验项目的决定性方法、参考方法、常规方法
2.参考物质的分级 参考物质(reference material,RM)又称标准物质、标准物或标准品,国际标准化委员会(ISO)对参考物的定义为:具有一种或几种理化性质已经充分确定的特性,用以校正仪器、评价测定方法或给材料赋值的材料或物质。参考物质分为校准物质和正确性质控物质。校准物质是在校准函数中其值被用作自变量的参考物质,用于测量系统校准或对材料赋值;正确性质控物质是用于评价一种测量系统的测量偏差的参考物质。
质控物用于常规质量控制,以控制病人标本的检测误差。根据有无测定值分为定值血清和未定值血清两种,其值可用适当的校准物以参考方法确定。质控物不能用于标定仪器或方法。在质控物的制备、定值和使用过程中,应严格按有关规程进行。
根据参考物质的校准性质一般可分为三级。
(1)一级参考物质(原级参考物、一级校准物、一级标准品):已经确定的稳定而均一的物质,所含杂质已经定量,是具有最高计量学特性的参考物质,其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定,一级标准品都有证书,属有证参考物质,在美国由国家标准和技术研究院(NIST)颁发证书,并指明其性质和有关数据。在我国,一级参考物质(如人血清无机成分分析标准品-GBW 09135和血清胆固醇标准品-GBW 09138)是测量准确度达到国内最高水平的有证标准物质,由国家质量监督检验检疫总局(AQSIQ)批准、颁布并授权生产。一级参考物质用于校正决定性方法,评价和校正参考方法及为二级参考物定值。
(2)二级参考物质(次级参考物、二级校准品或二级标准品):这类标准品可以是纯溶液(水或有机溶剂溶液),也可以存在于相似基质中。其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品校正而确定,主要用于常规方法的标化和控制物的定值,如胆红素标准物质-GBW(E) 090002、氰化高铁血红蛋白标准物质-GBW(E)090004、纯化血红蛋白标准物质-GBW(E) 090011等。在发达国家,二级参考物质通常是有证参考物质。
(3)工作校准物(working calibrator):可分为厂家工作校准物、厂家产品校准物,分别由厂家选定测量程序、厂家常务测量程序定值,一般临床实验室对样本进行常规检测程序使用的校准物多为厂家产品校准物。
各种分析方法与参考物质的相互关系及溯源途径见图2-2。
图2-2 各种分析方法与参考物质的相互关系及溯源途径
起点是决定性方法,其用于给一级参考物质赋值,也可提供更实际参考方法比较的基础。这样的参考方法和二级参考物质成为与常规方法真实性的实际关联,其在常规实验室完成,并依靠室内质控和室间质量评价进行监控。
实验室使用的检测系统是指完成一个项目的检测所涉及的仪器、试剂、校准物、测量程序、质量控制与保养计划等,其检测结果经一系列合理实验的验证,证实符合厂家声明的技术要求,其量值能够溯源到高一级的标准物质。因此在实际工作中,实验室使用检测系统进行样本检测时,其检测结果具有可溯源性。改变系统中的任何因素,其检测结果的可溯源性将被打断,如果必须改变系统中的某种因素,实验室在应用该改变方法前,应对改变后的系统做出适当的性能评价,以确定方法准确性的偏倚在允许范围内和检测结果的可溯源性。重点提示校准物与质控物
校准物用以校正仪器、评价测定方法,质控物用于临床实验室常规的质量控制,质控物不能用于标定仪器或方法。在实际应用中应加以区别,不可混用,既不能将质控物当做校准物使用,也不能把校准物当作质控物使用。
(二)常规方法的选择
1.常规方法选择的原则 实验方法选择要从实际出发,根据实验室的条件和检测要求确定适当的方法。条件优越的实验室应建立和选择参考方法,有利于对常规方法的评价和标准品的定值;一般临床化学实验室应结合仪器设备、技术力量、实验成本等因素,选择常规分析方法和使用方便的参考方法。
选择常规分析方法时,尽量选用国内外通用方法或推荐方法,便于方法的规范化和质量控制,重点考虑实用性和可靠性两方面的性能指标。我国实验室所使用的分析仪器和试剂,应具有国家食品药品监督管理局(SFDA)核发的相应文件。
(1)实用性:①微量快速。使用的样本量少,便于急诊,适合批量成套分析,且检测速度快;检测速度是指一份标本操作一次所需时间及在常规条件下单位时间内所能处理的标本数量。②方法简便。易于开展,操作人员无需特殊培训,试剂种类少,易于自动化分析。③费用低廉。无需昂贵试剂和仪器,每份成本费用与一次分析的标本数量有关,应区别单份标本及不同工作量时的费用。④安全可靠。试剂无毒,腐蚀性小,无需特殊防护措施。
(2)可靠性:所选方法应具有较高的精密度、准确度、特异性和稳定性,有较宽的测量范围,保证检测结果的准确性,能满足方法允许误差限度的要求。
2.常规方法选择的步骤
(1)广泛查阅文献:广泛、仔细查阅国内外已发表的相关文献,如最新版的《全国临床检验操作规程》等,有条件时通过实验室之间的交流或现场考察,还可参照国外或国内室间质量评价和能力验证的反馈信息,再根据方法选择的要求对各种方法进行比较,充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值,仔细分析方法特点。
(2)选定候选方法:根据实验室的设备条件、人员业务素质、工作量等具体情况,选择适合于本实验室具体条件的方法作为候选方法。有些反应条件可能还需要验证、探讨和调整,主要包括方法的吸收曲线与检测波长的选择、呈色的稳定性、反应温度和时间、样本和试剂的体积比、试剂的最佳配方、缓冲体系的种类及方法线性范围等。候选方法确定后,应写出该法的原理、参考文献、所用仪器、试剂来源和纯度、标本收集要求、具体的操作规程、结果计算和分析、参考范围、注意事项等。
(3)初步评价试验:对候选方法应做初步评价实验。包括:①标准曲线和重复性;②质控血清和新鲜标本的重复试验;③分析不同浓度的标本,并与公认参考方法的结果对比。
通过对候选方法的初步实验,使工作者熟悉有关技术,掌握各分析步骤要点,判断能否适合本室条件要求。根据初试所获得的资料,确定是否有必要作进一步研究。
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