散射光谱分析技术

带有小粒的悬浮液和胶体类物质具有向四面八方散射入射光的性质。测定光线通过溶液混悬液颗粒后的光吸收或光散射强度以测定物质组分含量的一种分析方法,称为散射光谱分析法。常用的方法为比浊法。

比浊法的原理:利用光线通过混悬液时,液体中的颗粒若小于入射光波长的1/2,则部分入射光被散射,使透射光相应减弱。在一定条件下散射光的强度(或透射光减弱的程度)和混悬液中的颗粒数量成正比,根据光线减弱的程度测定混悬液中颗粒的浓度。比浊法的测定原理、方法、计算等诸多方面与比色法相似,但本质不同。混悬液无特异吸收光谱,只是混悬液颗粒将入射光散射(遮挡),使透光度减弱。比浊法测定需用特殊的比浊计,如激光比浊仪。

比浊法方法简便,易于掌握,但精确性和特异性较差,易受外界诸多因素的影响,其中突出的问题是颗粒大小和浊度曲线的影响。因此,从制备混悬液至测定时应力求做到以下几点:①混悬颗粒大小应尽可能一致,使重复性好。②混悬颗粒在一定时间内,至少10min内应维持稳定,使颗粒不易相互聚集变粗、变大。③大多数混悬液随放置时间的延长,颗粒易变粗、变大从而加快沉淀,因此应及时比浊。如出现沉淀太快,可加入保护性胶体,如聚乙烯吡咯烷酮、表面活性剂等。④温度升高能加快分子间的碰撞,易使某些在室温下细小均匀的颗粒变为粗大的絮状沉淀。⑤溶液的p H影响沉淀的形成和沉淀颗粒的大小,如蛋白质、酶类在其等电点时最易形成颗粒并沉淀。⑥避免其他电解质和非电解质对沉淀反应速率与稳定性的影响。⑦在一定条件下,波长越短,散射光越强。所以,散射光的出现在紫外光区比可见光区灵敏得多。

目前临床生物化学检验中应用最多的比浊法是免疫比浊法,如载脂蛋白、免疫球蛋白、补体类,以及一些微量的特殊蛋白质,如C反应蛋白、前清蛋白、β2-微球蛋白等均用免疫比浊法快速定量。