电泳的原理及分型

(一)电泳的基本原理

生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸和核苷酸等在溶液中都具有可解离的酸性基团(如—COOH)和碱性基团(如—NH 2、咪唑基等),这些物质称为两性电解质。它们在溶液中既带正电荷,又带负电荷,在某特定的p H和电场作用下,这些带电粒子向着与其带电荷极性相反的电极方向移动。

物质颗粒所带静电荷的种类和数量随物质溶液p H不同而异,当溶液的p H正好使发生解离的物质正、负电荷数量相等,此时的p H为该物质的等电点(pI)。当p H=p I时,正、负电荷数相等,净电荷为零;当p H<pI时,正电荷数量大于负电荷数,粒子呈正电性;当p H>pI,正电荷数量小于负电荷数,粒子呈负电性。不同粒子带同种电荷时,其p I与p H相差越大,则电荷数越多,受电场作用力越大。

物质的电泳速度通常用电泳迁移率来表示,即带电颗粒在单位电场作用下的泳动速度,用公式表示

式中:μ为迁移率[cm2/(V·s)];v为颗粒的泳动速度(cm/s);E为电场强度(V/cm);d为颗粒移动距离(cm);l为支持物的有效长度(cm);V为加在支持物两端的实际电压(V);t为通电时间(s)。

各种带电物质在一定条件下测得的迁移率是一物理常数。迁移率的大小与该物质所带电荷量和电场强度及摩擦系数有关。

带电颗粒在电场中的移动速度与颗粒带电荷量及电场强度成正比,与摩擦系数成反比;摩擦系数决定于颗粒的大小、形状,以及所在介质的黏度系数。电泳物质基本是球形的,所以摩擦系数为6πrη,那么,带电颗粒在电场中的电泳速度为

式中:r为颗粒半径:η为介质黏度系数。

根据前式,带电颗粒的迁移率为

由于受待测物质所带电荷、相对分子质量和外界电场强度等因素的影响,在电场中泳动一段时间后,在支持物的一定位置上出现一条致密的区带。如果样品为蛋白质混合物,由于各种蛋白质的相对分子质量和等电点不同,电泳迁移率不同而得以分离。

(二)电泳的分型

按分离原理的不同可分为4类。

1.移动界面电泳 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术,在“U”形管中进行电泳,将待分离的离子(如阴离子)混合物置于电泳槽的一端(如负极),在电泳开始前,样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后,带电粒子向另一极(正极)移动,泳动速度最快的离子在最前面,其他离子依电极速度快慢顺序排列,形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的,达到完全分离,是电泳速度最快的离子,其他大部分区带重叠。因分离效果差,现已被其他电泳技术取代。

2.区带电泳 又称区域电泳,是在一定的支持物上,于均一的载体电解质中,将样品加在中部位置,在电场作用下,样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动,分离成一个个彼此隔开的区带,这是目前应用最广泛的电泳技术。区带电泳基于支持物的物理性状、装置形式、p H的连续性等不同,又可分为以下几种。

(1)按支持物物理性状:①滤纸及其他纤维素薄膜电泳,如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳。②凝胶电泳,如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳,制成凝胶板或凝胶柱。③粉末电泳,如纤维素、淀粉、琼脂粉等,将粉末与适当的溶剂调和,铺成平板。④线丝电泳,如尼龙丝、人造丝电泳,是一类微量电泳。

(2)按支持物的装置形式:①平板式电泳,电泳支持物(如凝胶)制成水平板状。②垂直板式电泳,板状支持物在电泳时,按垂直方向进行。③连续-流动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂直竖立,两边各放一电极,缓冲液和样品自顶端下流,与电泳方向垂直。④圆盘电泳,电泳支持物灌制在两通的玻璃管中,被分离的物质在其中泳动,区带呈圆盘状。

(3)按p H的连续性:①连续p H电泳,电泳的全部过程中缓冲液p H保持不变,如纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳。②非连续p H电泳,缓冲液和支持物间有不同的p H,如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等。

(4)按所用电压不同分为:①低压电泳,100~500V,电泳时间较长,适用于分离蛋白质等生物大分子。②高压电泳,1 000~5 000V,电泳时间短,有时只需几分钟,多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质分离。

3.等电聚焦电泳 将两性电解质加入盛有p H梯度缓冲液的电泳槽中,当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷,向负极移动;若其处在高于其本身等电点的环境中,则带负电荷,向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时,其净电荷为零,泳动速度下降到零,具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置,形成一个个清晰的区带,分辨率极高。

4.等速电泳 在样品中加有领先离子(其迁移率比所有被分离离子大)和终末离子(其迁移率比所有被分离离子小),样品加在领先离子和终末离子之间,在外加电场作用下,各离子进行移动,经过一段时间电泳后,达到完全分离。被分离离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流,所得到的区带是相互连接的,且因“自身校正”效应,界面是清晰的,这是与区带电泳不同之处。