1.随着电泳技术的不断发展和改进,自动化电泳分析已引入临床实验室,电泳技术在疾病诊断中发挥的作用越来越大,特别是为体液蛋白质、同工酶等的检测方面提供了新的手段。
(1)血清蛋白电泳:新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后,常见清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白5条区带。急性炎症或急性时相反应时α1、α2区带加深为特征;妊娠时α1区带增高,伴有β区带增高;缺铁性贫血β区带增高;肾病综合征、慢性肾小球肾炎清蛋白下降,α1-、β-球蛋白升高;慢性肝病或肝硬化清蛋白显著降低,γ-球蛋白升高2~3倍,甚至可见β~γ桥;单克隆Ig异常症(M蛋白血症)在α~γ区呈现致密而深染,高度集中的蛋白质克隆增生区带(M蛋白区带)。
(2)尿蛋白电泳:在无损伤时,用于协助判断肾病变的严重程度。尿蛋白电泳后呈现中、高分子蛋白质区带主要反映肾小球病变,呈现低分子蛋白质区带见于肾小管病变或溢出性蛋白尿(如本周蛋白),混合性蛋白尿可见到各种分子量区带,提示肾小球和肾小管均受累及。
(3)脑脊液蛋白电泳:将患者血清和脑脊液(CSF)同步进行电泳分析,如CSF标本中检出寡克隆区带,是中枢神经系统疾病的重要指标,主要用于多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、亚急性脑白质炎、神经性梅毒等中枢神经系统疾病的诊断和鉴别诊断。
(4)血红蛋白及糖化血红蛋白电泳:用电泳法鉴别血红蛋白(Hb)的类型及含量对于贫血的诊断及治疗具有重要意义。Hb A 2增高是β2轻型地中海贫血的典型表现,Hb A 2减低常见于缺铁性贫血及其他血红蛋白合成障碍性疾病(如α2地中海贫血)。电泳发现异常血红蛋白如HbC、Hb D、Hb E、Hb K和HbS等可诊断为相应血红蛋白分子病。在酸性条件下电泳,可将糖化血红蛋白的不同组分Hb A 1 a、Hb A 1 b和Hb A 1 c分离,糖化血红蛋白(Hb A 1 c)是血红蛋白与血糖结合的产物,可特异性反映测定前1~2个月体内葡萄糖水平。
(5)免疫固定电泳:对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型,常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。一般用于单克隆免疫球蛋白病、单克隆免疫球蛋白增殖病、多组分单克隆免疫球蛋白病、多克隆免疫球蛋白病、CSF寡克隆蛋白鉴别、本周蛋白和游离轻链病、重链病的诊断和鉴别诊断。
(6)同工酶电泳:临床上用于同工酶或同工酶亚型分析。
①乳酸脱氢酶(LDH)同工酶:用琼脂糖凝胶电泳(AGE)法可分离出5种同工酶区带(LDH 1~LDH 5)。主要用于急性心肌梗死(LDH 1>LDH 2)及骨骼肌疾病(LDH 5升高)的诊断和鉴别诊断。恶性肿瘤、肝硬化时LDH 5明显升高,或在胸腔积液、腹水中出现一条异常LDH 6区带。
②肌酸激酶(CK)同工酶:用AGE法可分离出3种CK同工酶。CK-MB在心肌梗死早期增加,短时间内达峰值也是心肌再灌注的指征。CK-BB增高见于脑胶质细胞瘤、小细胞肺癌和胃肠道恶性肿瘤等。
③CK同工酶亚型:指CK-MM亚型(CK-MM 1、CK-MM 2、CK-MM 3)和CK-MB亚型(CK-MB1、CK-MB2),采用琼脂糖凝胶高压电泳可进行CK同工酶亚型的常规快速分析,用于早期心肌损伤的诊断与鉴别诊断。主要用于急性心肌梗死的早期诊断,也可用于确定心肌再灌注、溶栓治疗后的病情观察。
④碱性磷酸酶(ALP)同工酶:可采用AGE法进行ALP同工酶的常规快速分析。肝外阻塞性黄疸、转移性肝癌、肝脓肿和胆石症时胆汁ALP检出率很高,并伴有肝ALP增加,肝内胆汁淤积、急性肝炎、原发性肝癌等主要表现为肝ALP增多,大多数不出现胆汁ALP。甲状腺功能亢进症、恶性骨损伤、佝偻病、骨折、肢端肥大症所致骨损伤等,均引起骨ALP同工酶增加。骨ALP、高分子ALP同工酶对恶性肿瘤骨转移或肝转移的阳性预示值较总ALP高。胃肠道肿瘤、肺癌等恶性肿瘤时出现类肠型ALP。
⑤γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT/GGT)同工酶:用CAE或AGE法可将γ-GT同工酶分离为γ-GT1~γ-GT4,正常人只见γ-GT 2和γ-GT3,重症肝胆疾病和肝癌时常有γ-GT1出现,γ-GT 4与胆红素增高密切相关。
(7)脂蛋白电泳:脂蛋白电泳主要用于高脂血症的分型、冠心病危险性估计,动脉粥样硬化及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗效果观察的研究。
2.下面介绍醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法。
(1)目的:理解醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本原理及质量保证,学会基本操作步骤,了解血清蛋白电泳的主要临床意义。
(2)原理:利用不同蛋白质的分子大小和表面电荷的差别,在直流电场中泳动速度不同将蛋白质分离。血清中各种蛋白质的等电点(pI)均低于7.0,在p H8.6的缓冲液中都带有负电荷。由于各种蛋白质的pI不同,带电荷量不相等,加之分子大小不一,导致在电场中的泳动速度不同,带电荷越多泳动速度越快;分子量和体积越大的蛋白分子泳动速度越慢;等电点低的蛋白质分子泳动快,等电点高的泳动慢。按其泳动速度可从正极起,依次分离出清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白5个组分,它们的相对分子质量及等电点见表3-2。
表3-2 血清蛋白各组分的分子量及等电点
将蛋白质固定染色后,洗去多余染料,可观察清晰的色带。将各色带剪开,分别溶于碱性液中,进行比色分析,计算出各种蛋白质的百分含量,或用光密度扫描仪扫描定量。
(3)器材与试剂
①器材
a.电泳仪:选用稳压直流电源,电压0~600V,电流0~300m A。
b.电泳槽:适合醋酸纤维薄膜的电泳槽,电极用铂(白金)丝。
c.血清加样器:可用10μl的微量吸管或专用的电泳血清加样器。
d.光密度扫描仪。
e.分光光度计。
②试剂
a.巴比妥缓冲液(p H8.6,离子强度0.06):取巴比妥1.62g,巴比妥钠12.38g,用500ml蒸馏水加热溶解,冷却后,再用蒸馏水补足至1000ml。
b.染色液
氨基黑10B染色液:氨基黑10B 1g,三氯乙酸13.4g,磺基水杨酸(磺柳酸)13.4g,加蒸馏水溶解,并定容至1000ml。
丽春红染色液:丽春红2R 0.8g,溶于6%三氯乙酸100ml中。
c.漂洗液
氨基黑漂洗液:甲醇40ml,冰乙酸10ml,蒸馏水50ml,混匀。
丽春红漂洗液:2.5%(V/V)乙酸溶液。
d.洗脱液
氨基黑洗脱液:0.4mol/L NaOH溶液。
丽春红洗脱液:0.1mol/L NaOH溶液。
e.透明液:冰乙酸30ml,无水乙醇70ml,乙酸乙酯1ml,混匀。
f.醋酸纤维薄膜:规格:2cm×8cm。
(4)操作
①准备:将缓冲液加入电泳槽内,调节两侧槽内的缓冲液,使其液面处在同一水平面上,在电泳槽内侧支持板上搭桥(一般用4层滤纸或纱布)。
②醋酸纤维薄膜的准备:在醋酸纤维薄膜(2cm×8cm)的无光泽面(毛面)距一端1.5cm处,与端线平行用铅笔轻画一横线,作为点样线。把膜放入缓冲液中浸泡30min以上,使其完全浸透。
③点样:将浸透后的醋酸纤维薄膜取出吸干,用微量吸管或专用加样器吸取无溶血血清3~5μl在毛面点样线上加样,使血清全部渗入膜内。
④电泳:将点样后的醋酸纤维薄膜置于电泳槽架上,毛面向下,点样端置于负极侧,并拉直,用双层滤纸或4层纱布将膜的两端与缓冲液连通,平衡约5min后通电。电压为90~ 150V,电流为0.4~0.8m A/cm宽,夏季通电约45min,冬季通电约60min,待电泳区带展开25~35mm,即可关闭电源。
⑤染色与漂洗:通电完毕后,取出薄膜并水平移出,浸于染色液中固定染色5~10min后取出,用漂洗液反复漂洗数次,直到背景无色为止。用滤纸吸干多余的漂洗液,此时可见界限清晰的5条区带。
⑥定量:取6支试管编号,各加入0.4mol/L NaOH溶液4ml。剪开薄膜上各条蛋白区带,另于空白部位剪一平均大小的薄膜条,将各条分别浸于上述试管中,振摇数次后,置于37℃水浴箱20min,使染料浸出。氨基黑10B染色,用分光光度计选用620nm波长,丽春红染色选用580nm。用空白管调零,分别读取各管吸光度值。以各管吸光度值之和作为100%,求出各管吸光度值的百分数,即该种蛋白质占血清总蛋白的百分含量。
如使用光密度扫描仪扫描,需先将染色干燥后的薄膜置透明液中10~20min,取出贴于玻璃板上晾干。得到透明薄膜,可用光密度扫描仪描记电泳曲线(图3-3)。
图3-3 血清蛋白电泳光密度扫描曲线
(5)计算
式中:A T表示各组分蛋白吸光度总和;A X表示各个组分蛋白的吸光度。
(6)参考区间:清蛋白:55%~74%;α1-球蛋白:2%~5%;α2-球蛋白:4%~9%;β-球蛋白: 6.5%~12%;γ-球蛋白:12%~20%。
(7)质量保证
①电泳槽缓冲液的液面要保持一定高度,过低可出现γ-球蛋白的电渗现象,同时电泳槽两侧的液面保持在同一水平面上,避免虹吸现象产生,影响蛋白质分子的泳动速度。
②每次电泳完毕后应交换电极以使两侧电泳槽内的正、负离子相互交换,维持缓冲液的p H在一定水平。
③电泳失败或图谱不理想的原因常见于以下几个方面。
a.电泳图谱不整齐:点样不均匀、薄膜未完全浸透、温度过高致使水分蒸发、缓冲液变质、薄膜放置不正,使电流方向不平行。
b.样品分离不清晰:点样过多、电流过低、薄膜结构过密、透水性差、导电差等。
c.清蛋白中间着色浅:染色时间不足或染色液陈旧;清蛋白含量过高,可减少血清用量或延长染色时间。
d.电泳速度慢:电流过低、供给薄膜的水分不足、温度过低、薄膜结构致密,导电差、缓冲液蒸发使离子强度增加等。
e.薄膜透明不完全:薄膜未完全干燥即浸入透明液中、透明液中冰醋酸含量不足、浸透时间不够、透明过程中遇水分。
f.透明膜上有气泡:玻片上有油脂,贴膜时滚动不佳。
(8)临床意义:正常血清经电泳后,常见清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白5条区带。脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌,在清蛋白与α1球蛋白之间增加了一条甲胎蛋白带。常见电泳图谱异常如下。
①M蛋白血症:单克隆γ-球蛋白(M蛋白)血症,主要见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病及一些良性的M蛋白增多症。在β-球蛋白和γ-球蛋白后区段的各部分出现一条致密深染的M蛋白带。
②蛋白缺乏症:主要包括α1抗胰蛋白酶缺乏症、γ-球蛋白缺乏症等。临床上较少见。电泳图谱表现为α1-球蛋白和γ-球蛋白缺乏或显著降低。
③肾病:见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾衰竭等表现为清蛋白降低,α2-球蛋白和β-球蛋白升高。
④急性炎症或急性时相反应:α1-球蛋白、α2-球蛋白和β-球蛋白均升高。
⑤急慢性肝炎或肝硬化:清蛋白显著降低,β-球蛋白、γ-球蛋白升高2~3倍,可见两种球蛋白相粘连的“β-γ”桥,主要由于Ig A增高所致。
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