葡萄糖的测定方法

测定方法_生物化学检验技术

按性质分类,葡萄糖的测定方法主要有4大类,包括无机化学法(氧化还原法,亦称Folin-Wu法)、有机化学法(缩合法)、生物化学法(酶法)和仪器分析技术(如固相酶技术、生物传感器技术和核素稀释-质谱分析技术等)。其中无机化学法因特异性差,受血中其他还原糖的干扰,现已淘汰。有机化学法主要为邻甲苯胺法,因干扰因素多,试剂有腐蚀性和致癌性已很少使用。下面主要介绍酶法。

血糖的酶法检验是利用酶的特异性催化作用建立起来的,目前主要有葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)法、己糖激酶(hexokinase,HK)法和葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)法。其特点是灵敏度高,准确度和精密度好,反应条件温和,操作简单方便,适于自动化分析仪。

(一)葡萄糖氧化酶法

葡萄糖氧化酶法是血糖测定的推荐常规方法,也是目前国内各类医院使用最多的血糖测定方法。

【原理】 本法分为质谱分析法(速率法)和比色分析法两类。初始反应均为葡萄糖经葡萄糖氧化酶催化,氧化为葡萄糖酸(D-葡萄糖酸-δ-内酯),同时消耗溶液中的氧,并释放出过氧化氢。

【试剂】

1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液(p H 7.0) 称取无水磷酸氢二钠8.67g、无水磷酸二氢钾5.3g,溶于800ml蒸馏水中,用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节p H至7.0,蒸馏水定容至1L。

2.酶试剂 称取葡萄糖氧化酶1200U,过氧化物酶1200U,4-氨基安替比林10mg,叠氮钠100mg,溶于上述磷酸盐缓冲液约80ml中,用1mol/L NaOH调节p H至7.0,用磷酸盐缓冲液定容至100ml,置4℃保存,可稳定3个月。

3.酚溶液 称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中,贮存于棕色瓶。

4.酶酚混合试剂 酶试剂与酚溶液等量混合,贮存于棕色瓶中,4℃可保存1个月。

5.12mmol/L苯甲酸溶液 称取苯甲酸1.4g溶于约800ml蒸馏水中,加热溶解,冷却后,加蒸馏水定容至1L。

6.100mmol/L葡萄糖标准贮存液 准确称取无水葡萄糖1.802g,用12mmol/L苯甲酸溶液溶解并定容至100ml。2h以后方可使用。

7.5mmol/L葡萄糖标准应用液 吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml置于100ml容量瓶中,用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度,混匀。

【操作】

1.自动分析 自动生化分析仪参数设置参照有关试剂盒的说明书。按仪器说明书的要求进行测定。

2.手工分析 按表5-3操作。

质谱分析法是用氧电极监测溶液中氧的消耗量,后者与血液中葡萄糖的浓度成正比。

比色分析法是将GOD与过氧化物酶(peroxidase,POD)偶联,在POD的作用下,将色原性氧受体4-氨基安替比林和酚缩合成红色醌类化合物,即Trinder反应。该红色醌类化合物的生成量在一定范围内与葡萄糖含量呈线性关系,与标准管比较,可计算出血糖浓度。

表5-3　GOD-POD法测定血糖操作步骤

【参考区间】 见表5-2。

【质量保证】

1.葡萄糖氧化酶对β-D葡萄糖高度特异。溶液中的葡萄糖约36%为α型,64%为β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的变旋反应,新配制的葡萄糖标准液主要是α型,故须放置2h以上(最好过夜),待变旋平衡后方可应用。某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶,可加速这一反应,但在终点法中,延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。

2.尿液中尿酸等干扰物质浓度过高,可干扰过氧化物酶反应,造成结果偏低,出现假阴性。故该法不能直接测定尿液葡萄糖含量,但可直接测定脑脊液葡萄糖含量。

3.因红细胞的酵解将导致测定结果偏低,认为草酸钾-氟化钠的抗凝血浆较好。草酸钾-氟化钠抗凝剂的配制:取草酸钾6g,氟化钠4g,加水定容至100ml。吸取0.1ml于试管内,在80℃以下烤干使用。可使2~3ml血液在3~4d内不凝固并抑制糖分解。

4.严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液,然后再进行测定。

【应用评价】

1.用本法测定葡萄糖,从原理反应式可以看出,第一步反应葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯为特异性反应,而第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。某些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素、谷胱甘肽等,可与色原性物质竞争过氧化氢,从而消耗反应过程中产生的过氧化氢,产生竞争性抑制,使测定结果偏低,但添加了抗干扰成分的试剂盒可消除上述物质的干扰。

2.本法线性范围至少可达22.24mmol/L,回收率94%~105%,批内CV为0.7%~ 2.0%。批间CV为2%左右,日间CV为2%~3%。本法与己糖激酶法的相关系数高,其精密度与准确度均能达到临床要求,且操作简便,适用于常规检验,是卫生部临床检验中心推荐的方法。

【临床意义】

1.生理性高血糖 见于高糖饮食、情绪紧张等。

2.病理性高血糖

(1)糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病。

(2)内分泌疾病所致特殊类型糖尿病:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能亢进(库欣病)

混匀,置37℃水浴保温15min,放置冷却至室温,在505nm波长处,以空白管调零,分别测定标准管及测定管的吸光度值。

【计算】及髓质功能亢进(嗜铬细胞瘤)、垂体前叶功能亢进(巨人症、肢端肥大症)等,引起各种对抗胰岛素的激素分泌过多而出现高血糖。

(3)应激性高血糖:如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等,因颅内压增高刺激血糖中枢导致血糖增高。

3.生理性低血糖 见于饥饿、剧烈运动等。

4.病理性低血糖

(1)胰岛B细胞增生或胰岛B细胞瘤等,使胰岛素分泌过多。

(2)对抗胰岛素的激素分泌不足,如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质或甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素分泌减少。

(3)严重肝病患者,肝的糖异生作用降低或肝糖原储备缺乏,肝不能有效地调节血糖。

(二)己糖激酶法

己糖激酶法是血糖测定的参考方法,特别适用于急诊检验,但试剂较贵。

【原理】 葡萄糖与ATP经己糖激酶催化,生成葡萄糖-6-磷酸与ADP。葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PD)的催化下脱氢,生成6-磷酸葡萄糖酸,同时使NADP+还原成NADPH和H+。NADPH的生成速度与葡萄糖浓度成正比,在340nm波长处监测NADPH吸光度升高速率或采用终点法进行检测,与标准管比较,可计算出血糖浓度。

【试剂】

1.酶混合试剂 己糖激酶测定葡萄糖,多用试剂盒,目前国外生产试剂盒的厂家很多,其配方大同小异。

酶混合试剂的组成成分与浓度如下

三乙醇胺盐缓冲液(p H7.5) 50mmol/L

MgSO4 2mmol/L

ATP 2mmol/L

NADP+ 2mmol/L

HK ≥1500U/L

6-磷酸葡萄糖脱氢酶 2500U/L

按试剂盒说明书配制,置4℃保存。

2.100mmol/L葡萄糖标准贮存液 准确称取无水葡萄糖1.802g,用12mmol/L苯甲酸溶液溶解并定容至100ml,放置2h后方可使用。

3.5mmol/L葡萄糖标准应用液 吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml置100ml容量瓶中,用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度,混匀。

【操作】

1.速率法 自动生化分析仪参数设置参照有关试剂盒的说明书。

2.终点法 按表5-4操作。

表5-4　己糖激酶法测定血糖操作步骤

各管充分混匀,于37℃水浴中准确放置10min,在340nm波长处,用5mm比色皿,以蒸馏水调零,立即分别读取各管吸光度。

【计算】

1.速率法

2.终点法

【参考区间】 见表5-2。

【质量保证】

1.HK为反应的关键工具酶,必须使用高纯度产品,其比活性应>140U/mg酶蛋白(25℃)。HK的杂酶G-6-PD、谷胱甘肽还原酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应<0.01%HK活性单位,磷酸葡萄糖异构酶应<0.02%HK活性单位。G-6-PD也是反应的关键工具酶,其杂酶磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应<0.01%G-6-PD活性单位,谷胱甘肽还原酶和磷酸葡萄糖异构酶均应<0.02%G-6-PD活性单位。

2.HK的最适p H 6.0~9.0,pI为4.5~4.8。Mg2+为HK的激活剂,EDTA为抑制剂。从酵母中获得的G-6-PD,需NADP+作为辅酶,最适p H>8.5;如使用细菌来源的G-6-PD,则以NAD+作为辅酶,最适p H为7.8。

3.NAD+或NADP+的纯度要求达98%以上。

4.对试剂的要求。试剂空白在保温30min时吸光度<0.1,保温6min与30min间吸光度变化<0.01;33.3mmol/L葡萄糖标准液保温30min后的吸光度在1.6~1.8,保温8min与30min吸光度之差<0.01。

5.实验过程中,应保证加样量的准确,并且应严格控制酶促反应条件,如反应温度、时间和缓冲液的p H等。

6.如果用耐热的葡糖激酶代替HK,既可提高专一性,又可提高稳定性。

【应用评价】

1.己糖激酶法的准确度和精密度高,特异性高于葡萄糖氧化酶法,干扰少,适用于自动分析,是目前公认测定血糖的参考方法,特别适用于急诊检验。

2.本法的线性范围可达33.31mmol/L,最高达40.8mmol/L。回收率99.4%~ 101.6%,平均为100.5%,准确度高。日内CV为0.6%~1.0%,日间CV为1.3%左右,精密度好。与质谱法比较,y=1.02x-0.5。与GOD-POD法比较,r=0.998,y=1.01x+0.190。

3.轻度溶血、脂血、黄疸、维生素C、氟化钠、肝素、EDTA和草酸盐等不干扰本法测定。但严重溶血致使红细胞内有机磷酸酯和一些酶类释放,消耗NADP+,可使葡萄糖测定值下降6.6%~32%。

【临床意义】 参见“葡萄糖氧化酶法”。

(三)葡萄糖脱氢酶法

葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖脱氢,生成葡萄糖酸(D-葡萄糖酸-δ-内酯)。其反应式如下

向反应液中加入变旋酶可缩短反应到达平衡的时间。在反应过程中,NADH的生成量与葡萄糖浓度成正比。

GDH对葡萄糖具有高度特异性,其测定结果与HK法具有良好的一致性。一般浓度的抗凝剂或防腐剂如肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、氟化物和碘乙酸等不干扰测定。胆红素85.5μmol/L,血红蛋白950mg/L,维生素C 2g/L,谷胱甘肽200mg/L,尿酸100mg/L,尿素20g/L,肌酐250mg/L等不干扰测定。但当胆红素342μmol/L和血红蛋白1g/L时,可使表观葡萄糖浓度分别增高0.72mmol/L和0.22mmol/L。脂血标本会干扰测定,须做标本对照管。