双缩脲法(biurea method)对各种蛋白质呈色基本相同,特异性和准确度高,精密度好,显色稳定,试剂单一,方法简便,灵敏度虽不高,但对血清总蛋白定量较为适用,是临床测定血清总蛋白的常规方法。
【原理】 血清(浆)中蛋白质的肽键(—CO—NH—)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两分子尿素缩合后生成的双缩脲(H 2 N—OC—NH—CO—NH 2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似,故称为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与血清总蛋白含量成正比,经与同样处理的蛋白质标准液比较,即可求得总蛋白质含量。
【试剂与器材】 可购商品试剂或自配。
1.6mol/L NaOH溶液 称取NaOH 240g,溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸冷却的去离子水)约800ml中,冷却后定容至1L,贮于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH,须先配成饱和溶液,静置2周左右,使碳酸盐沉淀,其上清饱和NaOH溶液经滴定后,算出准确浓度。
2.双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶(CuSO4·5H 2 O)3g溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸冷却的去离子水)500ml中,加入酒石酸钾钠(Na KC4 H 4 O6·4 H 2 O,用以结合Cu2+,防止Cu2 O在碱性条件下沉淀)9g和碘化钾(KI,防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2 O的离析) 5g,待完全溶解后,再搅拌加入6mol/L NaOH溶液100ml,并用蒸馏水定容至1L,置塑料瓶中密闭保存。此试剂室温可稳定半年,若贮存瓶中有黑色沉淀出现,需要重新配制。
3.双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外,其余成分与双缩脲试剂相同。
4.60~70g/L蛋白质标准液 常用牛血清清蛋白或收集混合血清(无黄疸、无溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清),经凯氏定氮法定值,亦可用定值参考血清或标准清蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差,不能用作血清总蛋白测定的标准物。
5.仪器 自动生化分析仪或分光光度计。
【操作】
1.自动生化分析仪法 参数设置参照有关仪器及试剂盒说明书。
2.手工操作法 按表6-3操作。
表6-3 双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤
混匀,置25℃30min或37℃10min,在540nm处用1cm光径比色皿比色,用空白管调零,测各管吸光度。
如遇脂血浑浊、黄疸或溶血标本,需做标本空白管:取血清0.1ml,加入双缩脲空白试剂5.0ml,用双缩脲空白试剂调零,540nm波长,读取标本空白管吸光度。用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后的净吸光度,计算总蛋白浓度。
【计算】
【参考区间】 成年人65~85g/L。
【质量保证】
1.用标本空白管消除黄疸、溶血干扰,如标本空白管吸光度太高,可影响测定结果。
2.高脂血症浑浊血清会干扰比色,可采用下述方法消除:取2支带塞试管或离心管,各加待测血清0.1ml,再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml,塞紧并颠倒混匀10次后离心,倾去上清液,将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂和双缩脲空白试剂,再进行与上述相同的操作和计算。
【临床意义】
1.血清总蛋白升高
(1)血液浓缩:严重呕吐、腹泻、高热、休克,以及慢性肾上腺皮质功能减退等,由于水分丢失使血液浓缩,血清总蛋白明显升高,但清蛋白/球蛋白比值变化不大,称为假性蛋白增多症。
(2)合成增加:大多见于多发性骨髓瘤,主要是异常球蛋白增加,球蛋白可>50g/L,总蛋白可>100g/L。
2.血清总蛋白降低
(1)合成障碍:如慢性肝炎、急性肝细胞坏死、肝硬化等。
(2)血液稀释:如静脉注射过多低渗溶液或因各种原因引起的钠、水潴留。
(3)丢失过多:如大量失血、肾病综合征、溃疡性结肠炎等。
(4)其他:如慢性胃肠道疾病,消耗性疾病如严重结核病、甲状腺功能亢进症、肾病综合征、长期营养不良、恶性肿瘤等。
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