血清总胆汁酸测定

血清总胆汁酸(total bile acid,TBA)的测定方法有高效液相色谱法、放射免疫分析法和酶法。酶法又可分酶荧光法、酶比色法和酶循环法。近年发展的酶循环法灵敏度高、特异性好、应用前景好。

酶循环法原理为

在一定的反应时间内,酶循环产生的硫代NADH与样品中胆汁酸浓度成正比,与标准液比较计算样品中胆汁酸的含量。酶循环法测定TBA是一种通过脱氢酶-辅酶体系循环底物的方法。要求这种酶对硫代NAD+和NADH都有高度亲和力,反应体系的p H和缓冲液应允许正反应和逆反应都能进行,硫代NAD+和NADH浓度比例合适。这样使循环速率快(约100/ min),干扰因素较少。

酶比色法既可用于手工操作,亦可用于自动分析。下面介绍酶比色法测定总胆汁酸。

【原理】 血清中的总胆汁酸是一类具有3α-羟基的类固醇衍生物,在3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)作用下,脱氢生成相应的3-酮类固醇,此过程中将辅酶NAD+还原为NADH+H+,在黄递酶作用下,使NADH脱氢,同时使碘化硝基四氮唑(INT)还原为红色的甲臜。近年来开发出另一种工具酶3α-氧-5βΔ4类固醇脱氢酶(Δ4DH),作为3α-HSD的偶联酶,进一步催化3-酮类固醇脱氢,也可使INT还原为甲臜,从两条途径提高显色产物甲臜的浓度。甲臜的产量与总胆汁酸成正比。

【器材与试剂】

1.器材 试管、试管架、加样器、恒温水浴箱、分光光度计。

2.试剂

(1)试剂Ⅰ:黄递酶1000U,NAD+1mmol,碘化硝基四氮唑0.5mmol,丙酮酸50mmol溶于0.1mol/L磷酸缓冲液(p H7.5)1L中,加适量表面活性剂。

(2)空白试剂Ⅱ:3α-羟类固醇脱氢酶2000U溶于0.1mol/L磷酸缓冲液(p H7.5)1L。

(3)终止液:1mol/L HCl。

(4)胆汁酸标准液(50μmol/L甘氨胆酸钠):称取甘氨胆酸钠24.38mg,溶于1L经透析的混合血清中。

【操作】

1.手工法 按表9-10进行操作。

表9-10　酶法测定总胆汁酸操作步骤

摇匀,以蒸馏水调零,用500nm波长比色,读取各管吸光度值。

2.自动分析法 一般无法做对照管,通过设置两点终点法,分别读取前后两个吸光度A 1和A 2。具体按说明书要求。

【计算】

【参考区间】 空腹TBA为(4.9±2.38)μmol/L,浓度范围在0.14~9.66μmol/L;餐后2h为(8.22±2.91)μmol/L,浓度范围在2.4~14.0μmol/L。

【质量保证】

1.由于血清中TBA含量低,乳酸脱氢酶(LDH)是主要的干扰物质,对实验结果影响较大。LDH在其底物存在下(血清中含有一定量的乳酸),也可还原NAD+为NADH,产生高空白值,本法中加入丙酮酸钠,抑制LDH催化乳酸为丙酮酸的反应。血清中还存在其他脱氢酶和还原性物质,如不除去,结果也会偏高。

2.试剂中加适量表面活性剂可以防止甲臜沉淀。

3.反应混合物的吸光度受蛋白质影响,故甘氨胆酸钠标准液配制于混合血清中。

4.3α-HSD制品中含有二硫苏糖醇,酶制剂用量过多可影响INT的还原。

【应用评价】 与其他测定微量胆汁酸方法相比,酶比色法具有快速、简便、准确、可靠和适用等优点。它既可手工操作,也可在自动化分析仪上进行。但试剂价格贵、不易保持。对酶量的要求严格,以保证酶促反应在零级反应下进行,酶量不足易产生误差。此外,标准品的制备非常重要,常采用甘氨胆酸溶入小牛血清中制成冻干品。

【临床意义】 血清胆汁酸水平是反映肝实质损伤的一个重要指标,现已作为常规肝功能检测项目,对肝病诊断有重要价值。

1.急、慢性肝炎 急性肝炎血清TBA显著增高,可达正常水平的10~100倍。急性肝炎初愈者血清TBA由最初的高值几乎与GPT、GOT在同一时间降至正常水平,若持续不降或反而上升则有发展为慢性的可能。空腹总胆汁酸(F-TBA)和餐后2h总胆汁酸(P-TBA)测定对慢性肝炎的分型、监测、预后和疗效判定有重要意义。

2.肝硬化 肝硬化时胆汁酸的代谢能力减低,血清TBA在肝硬化的不同阶段均升高,其幅度一般高于慢性活动性肝炎,即使肝硬化晚期亦如此。当肝病活动降至最低时,胆红素、转氨酶及碱性磷酸酶等转为正常,血清TBA仍维持较高水平。某些肝硬化GPT等一般肝功能指标无明显异常,而TBA升高或明显升高,提示TBA测定对肝硬化的诊断和病情观察是一项有价值的指标。

3.酒精性肝病 酒精性肝病(包括肝硬化)严重肝损伤时,血清TBA明显增高,而轻、中度损伤增高不明显。血清TBA测定对酒精性肝细胞损伤诊断的可信度和灵敏度优于各种酶学检查和半乳糖耐量试验等指标,血清TBA和β-氨基己糖苷酶可作为酒精性肝病的诊断指标。餐后60min TBA测定对酒精性肝病的诊断更有意义,其他中毒性肝病血清TBA水平也异常。

4.胆汁淤积 血清TBA测定对胆汁淤积的诊断有较高的灵敏度和特异性,对肝外胆管阻塞和肝内胆汁淤积的鉴别有一定价值。肝外胆管阻塞及肝内胆汁淤积包括急性肝炎、初期胆管性肝硬化、新生儿胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等均可引起TBA增高。在胆管阻塞的初期,胆汁分泌减少,使血清中TBA显著增高,且在阻塞的不同阶段几乎保持不变,而血清胆红素水平则随不同阶段而变化。胆汁淤积肝组织中的胆汁酸含量明显高于正常人。肝外阻塞经引流缓解后,血清TBA水平迅速下降,而其他指标则缓慢恢复。