肿瘤标志物的检测与质量控制

(一)肿瘤标志物的检测方法

肿瘤标志物的检测方法主要包括以下几种。

1.生物化学技术 主要适用于检测各种酶及同工酶类肿瘤标志物,常用的有比色法、酶活性测定法及电泳法等。

2.免疫技术 随着科技的不断进步,免疫技术的特异性、敏感性、稳定性和快速等优越性使其越来越广泛地应用于临床,主要包括放射免疫技术(RIA)、酶联免疫技术(EIR)和荧光免疫技术(FIA),主要用于检测具有免疫原性的各类肿瘤标志物。

3.分子生物学技术 主要用于检测基因类肿瘤标志物,常采用聚合酶链反应(PCR)技术与其他技术相结合的方法,包括PCR-单链构象多态性法(PCR-SSCP)、PCR-限制性片断长度多态性分析(PCR-RFLP)、PCR-等位基因特异性寡核苷酸法(PCR-ASO)及PCR产物测序分析等。联合多项检测指标的蛋白质芯片技术逐渐受到人们的重视,如能合理应用多项检测指标,将提高对肿瘤诊断的敏感性和特异性。

回顾TM检测技术的发展历程,可将TM的检测方法归纳为8类。

1.放射核素标记的放射免疫分析(RIA)、放射免疫显像(RAID)、RNA印迹法(Northern blot)、DNA印迹法(Southern blot)、原位杂交(ISH)等。

2.荧光标记的免疫测定(IFA)、荧光原位杂交(FISH)等。

3.酶促化学反应呈色的免疫细胞化学(ICC)、免疫组织化学(IHC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot,WbB)等。

4.化学发光免疫分析(CLIA)、电化学发光免疫分析(ECLI)等。目前临床上多采用CLIA法或ECLI法。

5.以微粒子为载体的微粒子酶免疫分析(MEIA)。

6.稀土元素标记的时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)。

7.以体外DNA扩增为基础的PCR。

8.围绕蛋白质组学研究的双向电泳、生物芯片、质谱等多种检测技术。这些技术可以检测极微量的特异性抗原、糖脂、糖蛋白、癌基因和抑癌基因等TM,展现出广阔的用途。

尽管用于TM研究的检测技术很多,但真正用于临床的只有数种,如ICC、IHC、IFA分析主要用于肿瘤组织病理诊断,RIA和RAID主要用于放射核医学定位诊断和指导肿瘤外科手术。用于体液TM的检测技术,如ELISA、CLIA、ECLI、MEIA、TRFIA主要用于临床检验工作中。也有临床病理和检验交叉使用的检测技术,如PCR和IFA等。

(二)肿瘤标志物检测的质量控制

1.标本采集与保存 血清是测定TM最常用的标本。除少量酶类肿瘤标志物外,对标本采集无严格的时间要求。标本采集后应及时分离血清或血浆,室温测定,或于4℃冰箱保存,也可放-20℃(2~3个月内)或-70℃冰箱长期保存,避免标本反复冻融。注意引起TM升高的非病理因素,如前列腺按摩、前列腺穿刺、导尿和直肠镜检查等,溶血的影响较大,抗凝剂类型也可干扰检测。

2.质量控制 室内质控应包括阴性、阳性低值和高值三种质控血清,要涵盖TM的测定范围,保证测定结果具有良好的重复性。要求常规TM测定的批内CV<5%,批间CV< 10%。为保证室间质评的可比性,应尽量统一方法、仪器和同一批号的试剂。

3.其他因素 血清TM含量易受多种因素影响。如某些良性疾病和药物对TM的影响,标本污染及其他因素的干扰,如标本含量过高,应用ELISA法测定抗原和抗体易导致钩状效应(hook effect)的发生,引起TM测定结果假性升高。

到目前为止,还没有找到理想的具有100%灵敏度和特异性的TM。TM不仅在癌变时产生,在正常和良性疾病也呈不同程度的表达,且受机体某些生物活性因子的影响。因此,检测TM要注意假阳性和假阴性。引起假阳性的因素见于:①某些生理因素,如妊娠时AFP、CA125、HCG和月经时CA125升高。②某些良性疾病,如良性肝病AFP、CA19-9、CEA和TPA升高;肾衰竭β2-微球蛋白、CA15-3、CA19-9、CEA和PSA升高。③在肿瘤手术、化疗和放疗过程中,由于肿瘤组织破坏或肿瘤坏死,某些TM产生增加。引起假阴性的因素见于:①产生TM的肿瘤细胞少;②细胞或细胞表面被封闭;③体液中某些抗体与TM(肿瘤抗原)形成免疫复合物;④肿瘤组织本身血循环差,产生的TM不能分泌到外周血。