蛋白质提取的基本原则

提取蛋白质进行后续实验通常要求：①蛋白质完整性好，不被降解，能够反映组织的确切表达情况；②一些蛋白质实验要保证其足够的活性，实验条件不能损伤蛋白质的活性，例如分析粗提物中的酶活性。为了满足上述要求，在蛋白质提取过程中需要注意以下几个原则。

1．选择适当方法进行细胞的破碎 除去体液蛋白质，大多蛋白位于细胞内，所以在提取细胞内蛋白质时，首先需要选择合适的方法进行破碎细胞。破碎细胞的常用方法包括以下几种。

（1）高速组织捣碎法：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

（2）玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

（3）超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶。

（4）反复冻融法：将细胞在–20℃以下冷冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

方法的选择要因地制宜，同时要兼顾到靶蛋白的特性、实验的要求等诸多因素，进行综合考虑，确定最佳的方法。

2．根据所用材料选择合适的裂解缓冲液 上述破碎细胞的方法并不十分彻底，一些蛋白质仍然与膜、DNA或RNA结合，为了使蛋白更好地分离，进行下一步的实验，仍需化学裂解液进行处理。裂解液中常含有去污剂（如SDS、NP40或Triton X等）、去氧胆酸钠等。细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。

3．蛋白质提取步骤一般在冰上或4℃进行 由于细胞中含有大量的蛋白酶，为了保证所提取的蛋白不被降解，降低温度是抑制降解反应的一个重要措施。在提取蛋白质时要尽可能地在低温下进行。尤其是采用物理方法破碎细胞时，更应注意保持低温。

4．在提取过程中要加入适当的蛋白酶抑制剂 应用蛋白酶抑制是抑制蛋白酶活性重要的方法。由于蛋白酶种类非常多，而一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常是复合使用蛋白酶抑制剂。一些公司常将常用的蛋白酶抑制剂做成“鸡尾酒（cocktail）”，临用时加入裂解缓冲液中。例如，胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、抑肽酶（胰蛋白酶抑制剂，aprotinin）等，能够强烈抑制所有蛋白酶的活性（如丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶）；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶；Pepstatin A则对天冬氨酸蛋白酶有较好的抑制作用。PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟）为常用的蛋白酶抑制剂（配制时需用异丙醇溶解）。