基因工程表达蛋白的纯化

基因工程表达的蛋白质的存在形式可能会是：①在细胞质中，可溶；②包涵体形式，不可溶；③从细胞中分泌到培养基中；④分泌到周质间隙；⑤与细胞器或膜组分相关的。其存在形式会影响得到纯化起始材料所用的提取方式。

使用基因工程的方法进行提取、纯化蛋白质的一个优点是：可以在蛋白质的氨基端或羧基端加入标签序列（tag sequence），然后利用这些标签序列的性质进行纯化，常用的标签序列有：6×His，可用镍柱纯化；GST，可以用含有谷胱甘肽的柱子纯化。

这些蛋白质的表达方式可能会是：①正常的、成熟的、天然状态的蛋白质；②含有天然的前导肽，这种肽会被正常地加工处理；③与一种肽融合表达，这种肽对于蛋白质来说是非天然的；④缺乏糖基化或其他翻译后修饰，或未正确折叠。其表达方式会影响纯化所用的方法。

无论蛋白质的表达形式如何，分离这些蛋白质的基本流程是一致的，首先是收集细菌、裂解、过柱纯化（或吸附纯化）、检测等。在这里，将介绍含有6×His标签蛋白的纯化。

目前关于含6×His蛋白质纯化的介质有很多种，在这里简单介绍一下Merck 公司的NTA His•Bind 树脂纯化方法。

一、可溶性表达蛋白质的纯化

【操作步骤】

二、以包涵体形式表达的蛋白质纯化

这种蛋白质与可溶性形式的提取与纯化前面步骤是相同的，只是从收集靶标蛋白质以后不同，包涵体是以不溶形式存在的，需要进行变性处理，才能与树脂结合。

蛋白质提取所用的缓冲液组成成分见表11-2。

表11-2 蛋白质提取所用的缓冲液组成成分

三、常见问题

1.纯化的蛋白质中含有较多的杂蛋白质 尽管大肠杆菌中含有相邻连续组氨酸残基的蛋白不多，但一些蛋白质也可以与Ni离子微弱结合，为了去除多余的杂蛋白，可以采取以下措施：①在裂解缓冲液中加入一定量的β-ME（β-巯基乙醇，使用Ni-NTA树脂时）或DTT（二硫苏糖醇，使用Ni-IDA树脂时）；②增加漂洗缓冲液的咪唑缓冲液的浓度到50mmol/L；在包涵体形式蛋白纯化时，可以降低漂洗缓冲液的pH为6.0，以去除杂蛋白。

2.纯化的效率低 在蛋白质表达量比较丰富时，出现此问题，可能的原因是洗脱的条件比较温和，尤其是有些蛋白质的氨基端和羧基端都加入了His标签，此时最好以pH 梯度或咪唑梯度洗脱，确定最佳洗脱条件。

（张 宝）