双缩脲试剂测定血清蛋白质含量

Lowry法又称Folin-酚试剂法，是较早发展的一种灵敏的检测方法。所用的试剂是由两部分组成的：一部分相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起呈色反应；另一部分为Folin-酚试剂，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。

此法的优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干扰物质较多。

【材料】

1．试剂

（1）牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）：准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250ml。

（2）碱性硫酸铜溶液

①碱溶液：Na2CO3 2g溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。

②硫酸铜溶液：CuSO4•5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L（1%）酒石酸钾钠中。

使用前将①与②按50∶1混合即成碱性硫酸铜溶液。使用时新鲜配制。

（3）Folin-酚试剂：在2L磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4•2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）25g，水700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后用小火回流10h。冷却后，再加硫酸锂（Li2SO4•H2O）150g，水50ml，数滴（2～3滴）液体溴（也可用30%H2O2 6～8滴代替），然后开口沸腾15min，去除过量的溴（因溴气甚毒，这一步应在通风橱中进行），冷却后加水至1 000ml，过滤，溶液呈黄色（如带绿色则不能用），保存于棕色瓶中置冷暗处备用（如配制时间较长，试剂转呈绿色，可再加液体溴数滴，煮沸15min，若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用）。

（4）蛋白质样品：血清，使用前稀释约100倍（表12-1）。

2．设备 恒温水浴箱、分光光度计。

表12-1 蛋白标准物及样品 的稀释表（ml）

【操作步骤】

【计算】

1. 绘制标准曲线 以吸光度值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2. 计算样品蛋白质浓度 将血清样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的标准牛血清白蛋白溶液的质量浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数，然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清含蛋白质的克数，即每毫升血清中含蛋白质的克数。