真核生物染色体复制的特点

真核生物的DNA复制基本上与原核生物相似，但是更为复杂，而且了解得也不够充分。真核生物DNA的结构形式有一些特点：首先，真核生物DNA分子较大，通常在108到109个碱基对以上，而原核生物DNA分子较小，一般在106个碱基对左右；其次，真核生物的DNA不是裸露的，而是与组蛋白紧密结合，以染色质核小体的形式存在，DNA复制时先要有核小体的解开，因而减慢了复制叉行进的速度；再次，真核生物DNA复制与细胞周期密切相关，基因组DNA的复制只发生在细胞周期的合成期（S期），在S期的前后有G1期和G2期，将S期与M期（细胞分裂期）分开，而各期之间的转变受到一些基因产物的调解。另外，在S期中核内DNA的合成完成一次，而且仅此一次（once per cell cycle），新的DNA复制必须待细胞分裂结束后才重新开始，而原核生物DNA复制时，一个复制过程没有结束，第二个复制过程就可以开始。真核生物的DNA复制还有其他一些特点，将从下面几个方面进行介绍。

（一）复制起始点及方向

原核生物的线性DNA复制通常是从一个特定的复制起始点开始，即只有一个起始点，而且是以形成一个复制叉进行单向复制；真核生物染色体上有多个复制起始点，它们相距5～300kb，两个起始点之间的DNA片段称为一个复制子（replicon）。真核生物可以在几个复制点上同时进行复制，而且是形成两个复制叉进行双向复制（图3-6B）。例如人的染色体上平均有100个复制点，可以同时在200个复制叉上进行DNA的复制。所以尽管真核生物DNA的分子很大，但由于复制点多且为双向复制，因此从总体上可以快速进行合成。

对人及高等哺乳动物DNA复制起始点的了解远不如对原核生物以及酵母菌DNA复制起始点的了解。1998年Aladjem等通过实验证实人的β珠蛋白基因中有一个8kb的片段具有起始DNA复制的功能。这个片段中的基本位点（2～4个）具有较高的DNA复制起始功能，这些位点可能是DNA复制的特定起始点。

根据真核生物DNA复制速度推算，如果所有复制子同时开始复制的话，在1h以内基因组就可以复制完毕。事实上，典型的体细胞S期可持续6h以上。也就是说在S期的不同时间有不同的复制子进行复制的起始。这种选择性的起始机制仍在探讨之中。

（二）DNA聚合酶

真核生物主要的DNA聚合酶主要有五种，分别命名为DNA聚合酶α（Polα），DNA聚合酶β（Polβ），DNA聚合酶γ（Polγ），DNA聚合酶δ（Polδ），DNA聚合酶ε（Polε），都具有催化沿5′→3′方向核苷酸聚合反应的功能。其中，参与染色体DNA复制的是Polα（延长随从链）和Polδ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是Polγ，Polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，Polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。各种酶功能见表3-2和表3-3。

表3-2　真核细胞DNA聚合酶的分类及功能

表3-3　真核细胞几种主要DNA聚合酶的性质

真核生物DNA聚合酶的聚合速度比原核生物DNA聚合酶的聚合速度慢，大约为50个核苷酸／秒，仅为原核生物的1／10。但真核生物DNA聚合酶的含量大，一般超过20 000个分子，而大肠埃希菌中的DNA聚合酶仅有几十个分子。

真核生物DNA的复制除DNA聚合酶外还有其他多种复制因子参与，Polδ只有在与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）结合后才能发挥其聚合作用。真核生物DNA复制也包括RNA引物和冈崎片段的合成，但引物的长度仅约10个核苷酸，而原核生物的引物可长达数十个核苷酸。真核生物冈崎片段长100～200个核苷酸，而原核生物可达1 000～2 000个核苷酸。

（三）末端复制与端粒酶

真核生物线性DNA复制时，随从链合成的各片段去除引物后，是由DNA Polδ来填补空隙。但是最后的片段取出引物后，由于DNA Polδ不能催化3′→5′合成反应，以至于线性DNA末端的空隙无法补充，这样会造成子代DNA分子上有一条不完整的5′末端，DNA链也会随着不断地复制而逐渐地缩短（图3-14）。

但是，事实并非如此，因为真核生物线性染色体的末端有一种特殊结构，称为端粒（telomere），又称端区。端粒的结构中有核苷酸重复序列，该序列富含鸟嘌呤碱基，一般在一条链上是Gy（T／A）x，互补链为Cy（A／T）x；其中Y＞1，X为1～4。例如，人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列。端区具有特殊的生物学作用，在端粒酶（telomerase）参与下，确保染色体DNA复制的完整（图3-15）。

图3-14　DNA复制后，线性DNA分子变短的两个原因

在两个示例中，亲代分子以通常的方式进行复制，前导链可形成完整的拷贝。A．滞后链不完整是因为滞后链的最后一个冈崎片段未合成。滞后链的冈崎片段的引物合成通常应在间隔200bp的位置上。如果一个冈崎片段的合成发生在距离滞后链3′端不足200bp，那么就没有足够的空间引发另一次合成，因此滞后链最后的片段就不能复制，所产生的子代分子具有突出的3′端，当它复制时，合成的下一代分子就比原来的亲代分子短。B．最后一个冈崎片段位于滞后链的3′端，由于无法在滞后链的末端再延伸出一段冈崎片段，故其RNA引物不能转为DNA。引物RNA是否能在整个细胞周期中存在，它能否在下一轮DNA复制中转为DNA，都还不清楚。如果不能，则其中一条下一代分子会短于其亲本链

图3-15　人类染色体末端的延伸由端粒酶完成

显示人染色体DNA分子3′端。人端粒是由5′-TTAGGG-3′端粒基序重复组成。端粒酶RNA与DNA分子末端进行碱基配对并使多聚核苷酸延伸一小段，其长度可能由端粒酶RNA的茎-环结构所决定。端粒酶RNA沿DNA多聚核苷酸转移到另一个新的不远的碱基配对处，将DNA分子再延伸几个核苷酸。这一过程不断重复直至染色体末端足够长

端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的酶。其RNA组分有150～190个核苷酸，在端粒合成过程中，端粒酶以其自身携带的富含胞嘧啶的RNA为模板合成互补链。故端粒酶可看做是一种特殊的携带模板的反转录酶。端粒DNA合成过程可分为三步：①端粒酶结合在DNA的TG引物及端粒酶内部RNA模板上；②端粒酶以RNA为模板，以dGTP和dTTP为原料在染色体DNA末端进行聚合作用；③伸长的DNA末端与RNA模板配对解开，重新定位于模板的3′部位，开始下一轮的聚合作用。经过多次移位、聚合的重复循环，直至端区的TG链合成达到一定长度后终止。至于端区的CA链如何合成目前尚不完全清楚。有人设想当富G链足够长时，引发酶-DNA聚合酶α复合体就能结合于其末端，以正常方式启动合成DNA的互补链（图3-16）。然而矛盾之处在于，由于这需要一个新的RNA引物，那么含富C的链就应比富G链短。但是，比较子代分子与亲代分子，我们发现它们的染色体DNA全长并未变短。还有可能是富含G的序列有一特点，它能以非标准的G-G配对而折叠起来，为合成端区的CA互补链提供了引物，继而进行聚合反应。

图3-16　染色体末端延伸过程的完成

如图所示，端粒酶延伸3′端足够长度后，一个新的冈崎片段会被引发、合成，使3′延伸的片段转变成为一个完整的双链末端

研究表明，端区的平均长度是随着细胞分裂次数的增加及年龄的增长而变短。端区DNA逐渐变短，导致染色体稳定性的下降，这可能是引起衰老的一个重要原因。端粒酶可以刺激细胞的分裂，其表达可促使肿瘤细胞的无限分裂。因此对端粒酶活性调节的研究对衰老、肿瘤以及增殖均有重要意义（图3-17）。

图3-17　培养细胞经多次分裂后会老化

关于人的端粒酶，已有三种成分得到确认：①广泛存在于各种组织细胞中的RNA成分（human telomerase RNA component，hTR／hTRC）；②拥有与已知的反转录酶相似活性的催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase，hTRT／hTERT），在多数恶性肿瘤以及具有再生能力和分化潜能的细胞中处于激活状态，而在大多数终末分化的正常体细胞中处于抑制状态；③端粒酶相关蛋白（TEP／TLP1／TP1）。在体外，仅有hTR与hTRT两种成分就足以体现出完整的端粒酶活性。