真核细胞的蛋白质定位

对于蛋白质定位，主要有两大问题需要回答：一是寻找存在于蛋白质分子结构中的细胞定位信号；二是揭示蛋白质分子进行精确定位的分子机制。细胞定位信号可以以不同形式存在于蛋白质结构中，如氨基酸组成、氨基酸序列、蛋白质的空间结构、蛋白质的修饰信号等。其中研究较多的是存在于氨基酸序列中的定位信号，使蛋白质进入分泌途径的信号位于N-末端；使蛋白质进入线粒体和叶绿体的信号也位于N-末端；使蛋白质进入细胞核的信号位于肽链的中间，使蛋白质进入过氧化酶体的信号位于肽链的C-末端。

（一）线粒体蛋白质的定位

用同位素进行的脉冲标记-跟踪试验证明，位于线粒体不同部位的几百种蛋白质分子（除少数几种在线粒体基质中的核糖体上合成外）绝大多数都是在细胞液中核糖体上合成并释放后再转运到线粒体中的。且这些蛋白质在细胞液中都是以一种前体的形式合成的。这些前体蛋白的N-末端一般都带有一段并不完全相同但含有共同模体的所谓的“基质导入序列”，其共同特征：富含带正电荷的氨基酸（主要是精氨酸和赖氨酸），经常含有丝氨酸和苏氨酸，不含酸性氨基酸（如天门冬氨酸和谷氨酸）。进入线粒体基质和插入线粒体内膜的蛋白质（如柠檬酸合酶和细胞色素C氧化酶等）只含有上述信号肽。而进入膜间质的蛋白质（如细胞色素C）前体除了含有上述信号肽以外还含有一段紧接在后面的所谓的“膜间质导入序列”，同样，在将插入到外膜的前体蛋白（如外膜孔道蛋白）的上述共同信号肽之后紧接有一段所谓的“停止转运和外膜定位序列”。当转运结束后，对进入线粒体基质、内膜、膜间质中的蛋白质前提而言，上述共同信号将都会被特异的细胞基质蛋白酶切除，但进入外膜的信号序列将不被切除而留在蛋白质分子中。

据已有的观察结果，一个蛋白质分子转运进入线粒体基质的一般性模型大约包括以下步骤：①前体蛋白在细胞液中的自由核糖体上被合成，并释放到细胞液中；②细胞液中的分子伴侣蛋白，线粒体输入刺激蛋白（mitochondrial import stimulating factor，MSF）或Hsp70，与还未完全折叠好的前体蛋白质分子结合，以维持这种非天然构象，并阻止它们之间的聚集；③前体蛋白上的信号序列与线粒体外膜上的特异受体／外膜转运复合体识别，并被转运跨过外膜；④前体蛋白在膜间质中与位于内膜上的“内膜转运酶复合体”接触并被转运进入线粒体基质；⑤前体蛋白上的基质导入序列被线粒体基质中的特异蛋白水解酶切除，然后蛋白质分子自发地或在分子伴侣蛋白帮助下折叠形成其天然结构。

上述模型主要是基于对酵母和脉孢菌这两种模式生物的研究提出的，但有迹象表明，这种转运机制是高度保守的。在人体细胞中蛋白转运进入线粒体的机制与上面所描述的基本一样。这种转运系统的缺陷会导致相应的疾病发生，如Mohr-Tranebjaerg综合征就是因为将蛋白转运进入线粒体通路上的一个蛋白分子出现功能缺陷而引起的。

（二）细胞核蛋白质的定位

蛋白质进入细胞是一个非常复杂的过程，细胞核膜不同于其他细胞器膜：一方面它由脂质双层组成，外层膜与内质网相连，内层膜则通过核片层蛋白形成染色体的附着位点；另一方面核膜是不连续的，上面有一系列核孔，沟通细胞核与细胞质。核膜对一些分子是自由开放的，分子质量小于40ku、直径不大于23的分子可以以扩散的方式通过核孔进入细胞核，但是分子质量较大的蛋白质则不能自由进出，除组蛋白有专门的受体介导外，其他大的蛋白质进入细胞核均需要有特定的入核信号-核定位信号（nuclear localization signal，NLS），而且都是通过体积巨大的细胞核孔复合体进入细胞核的。

蛋白质在细胞质中合成后被运送到细胞核中的分子过程是近年研究的一个热点。在细胞质中，核蛋白被合成、并折叠成特定的三维空间结构，核定位信号暴露在表面，在输入蛋白（improtin）的帮助下进入细胞核。输入蛋白含有αβ两个亚基，α亚基的NLS与入核蛋白的NLS结合，β亚基与核孔蛋白质结合，被转运进入细胞核。蛋白质进入细胞核是一个消耗能量的过程，由ras相关的核蛋白质Ran调控。Ran是一个小的GTP酶，可以与GDP或GTP结合，Ran-GDP帮助输入蛋白质进入细胞核；Ran-GTP介导空载的输入蛋白β亚基出核，图7-8为蛋白质进入细胞核和输出细胞核的过程。Ran-GTP在Ran GTP激活蛋白的作用下GTP被水解成GDP；细胞质中形成的Ran-GDP与β亚基脱离后，可能通过某种机制再被运回到细胞核中，然后在一种叫做Ran核苷酸交换因子的作用下被转变成Ran-GTP形式，α亚基能自由地通过核孔。这样，α、β亚基和Ran-GTP／Ran-GDP都可以在细胞质和细胞核中进入另一轮的核蛋白转运循环。

（三）分泌蛋白的定位

利用同位素示踪技术以及蛋白水解酶实验表明，在真核细胞中很多新合成的蛋白质分子很快就进入了内质网的腔中被保护起来。随后，蛋白质可以通过特定的分泌途径转运到细胞外。Blobel的“信号假说”认为在新生肽链上最初形成的一些氨基酸具有信号功能，决定了相应的蛋白质是否被分泌。经过系统研究发现，蛋白质新生肽链进入分泌途径是在其N端的信号肽引导下完成的。当合成的肽链长度为大约70个氨基酸残基时，最先被翻译出来的N-末端序列作为“信号序列”伸出核糖体，并被存在于细胞液中的所谓“信号识别颗粒”（signal recognition partical，SRP）所特异结合，同时新生肽链的合成也暂时停止。然后所形成的复合体再与内质网膜上的所谓SRP受体特异识别和结合。之后，信号识别颗粒及其受体将脱离核糖体，同时，新生肽链进入存在于内质网膜上的转位子打开的通道中。这时，新生肽链的合成重新启动，合成的新生肽链加入内质网腔中，并在信号肽被切除后，在分子伴侣的作用下折叠成其天然构象。

以SRP为中介，信号肽依靠中间肽段的疏水性，与内质网的脂质双层相互作用，在信号肽的引导下，核糖体进一步与内质网发生蛋白质-蛋白质相互作用，随后新生肽链通过内质网膜上的特定通道，即转位器。转位器为圆柱形的寡聚体，为一亲水性通道，最小的转位器有SRP受体、Sec61p复合物和一个转位器相关膜蛋白（TRAM）组成。一旦信号肽序列从核糖体上伸出，还在延伸的、仍与核糖体结合的新生肽链的信号肽和SRP结合，SRP与其受体结合；带有新生肽链的核糖体与内质网膜结合，保证新生肽链准确无误的附着并进入内质网膜。在内质网膜上的转位器正常状态下处于关闭状态，只有当核糖体与转位器正确对位接触后，转位器的中央通道与核糖体大亚基的中央通道对齐，信号肽触发转位器瞬间开放，延伸中的新生肽链进入内质网。另一方面，SRP在新生肽链转运进入内质网的过程中起中介作用，一旦新生肽链进入转位器中，它就和其受体分离，重新游离于细胞质中，再次与新生肽链的信号肽结合，在信号肽的引导下，通过SRP的循环运作，新生肽链源源不断地被转运到内质网内。

图7-8　蛋白质进入细胞核和输出细胞核

A．带有入核信号的蛋白质进入细胞核的过程；B．输出蛋白进入细胞核的过程

由于信号肽序列不存在于成熟蛋白质分子中，因此，只能从细胞内分离出不成熟的新生肽链，然后测定它们N-末端的氨基酸序列，经比较研究发现，进入内质网的分泌蛋白新生肽链N端信号肽序列并没有很高的同源性，但也有一些规律：长度一般为16～30个氨基酸残基；含有1个或多个碱性氨基酸残基；随后是6～12个疏水性氨基酸残基。

内质网中的蛋白质分子根据各自结构中所携带的信号的不同可以有以下去向：①通过高尔基体和运输小泡而被调节性地（如胰岛细胞中的胰岛素、胰岛细胞中的胰高血糖素、胰岛腺泡细胞中的各种蛋白酶原、乳腺细胞中的酪蛋白和乳白蛋白等）或非调节性地（如肝细胞中的白蛋白和转铁蛋白、淋巴细胞中的免疫球蛋白、成纤维细胞中的胶原蛋白和粘连蛋白等）运送到细胞外面去；②通过运输小泡被运送到溶酶体中（各种酸性水解酶）；③先输送到高尔基体，然后再通过运输小泡回内质网腔。

除了上述途径外，新生肽链还可以通过另一种不依赖SRP的途径进入内质网。

（四）过氧化物酶体蛋白

过氧化物酶体蛋白是真核细胞中除去细胞产生的过氧化氢的细胞器，此外还有一些脂质、固醇、嘌呤，也在此细胞器中降解，因此，从某种意义上讲，它是一个与生物降解有关的细胞器。其中含有进行脂肪酸氧化的所有酶，以及将过氧化氢分解成水的过氧化氢酶。研究发现，所有过氧化物酶体基质中的蛋白以及膜蛋白都是在细胞液中自由核糖体上合成后，经过折叠形成了天然空间构象再被转运的。

目前，在此类蛋白质分子上已经鉴定出了两类较为普遍存在的信号肽段。一类是过氧化氢酶、脂肪酰辅酶A氧化酶、尿酸盐氧化酶等蛋白的C-末端都存在的一保守SKL序列，这个由3个氨基酸残基组成的序列对于蛋白转运进入过氧化物酶体而言是必需和充分的，但必须是位于C-末端；另一类是在N-末端的SKL序列，如硫解酶，两类都与过氧化酶体膜上的转运结合蛋白受体（分别为PTS1R和PTS2R）结合，通过受体介导途径进入过氧化物酶体，而且在蛋白进入后信号肽序列也不会被切除。

（五）各种膜蛋白的插入和定位

在细胞和细胞内各种亚细胞结构膜上都定位着很多蛋白质，存在于粗面内质网膜、真核细胞质膜、滑面内质网膜、高尔基复合体膜、溶酶体膜等膜蛋白是从粗面内质网上进入后再转运到这些膜上的。蛋白质在膜上的定位方式有两种：一种是通过肽链穿越膜而定位，这些蛋白不是随机地插入膜上的，而是具有特定位向的，即其N-末端或者位于细胞膜上的一侧，而C-末端却位于另一侧。很多这样的膜蛋白是通过一个螺旋跨膜的，比如在红细胞质膜上含量丰富的血型糖蛋白，在肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体等；另一种是在肽链中的某些氨基酸残基接上了疏水的脂质分子，依靠脂质分子的牵引定位在膜上，插入膜中的脂质分子仅在膜质的一层，或是外层一侧，或是内层一侧。

穿膜蛋白质，其蛋白质肽段的穿膜机制主要是利用N端的信号肽作为穿膜的起始信号，在新生肽链的另一肽段作为穿越膜的终止信号，一是作为终止信号的肽段进入内质网膜，蛋白质就定位于膜上了，起始信号和终止信号区域几乎都是疏水性氨基酸相对集中的肽段，随着新生肽链的延长，新合成的肽段就留在胞质中了。如果新生肽链中存在多个穿越膜的起始信号和终止信号，这样的肽链可以多次穿越膜。不过，有一些穿膜蛋白质的起始信号并不是N端的信号肽，二是新生肽链内部的一个肽段，如果这段信号肽的C端碱性氨基酸残基较多，带有正电荷，得到的是Ⅰ型膜蛋白；反之如果这段信号肽的N端带正电荷，穿膜后得到的是Ⅱ型膜蛋白，肽链的N端在细胞质中，而其C端的部分或是在细胞外，或是在一些细胞器的腔面一侧。

膜上的蛋白质还可通过共价连接的糖基磷脂酰肌醇插入质膜表面。这类蛋白质以Ⅰ型膜蛋白的前体形式被合成，然后，在酶的催化下发生转肽反应，将前体肽链的C端部分的疏水肽段留在质膜中，其余的大部分肽链转移到已经合成的糖基磷脂酰肌醇衍生物中的乙醇胺的氨基上，从而使蛋白质的肽链通过糖基磷脂酰肌醇锚定在质膜外表面。

膜上的蛋白质可以在肽链中的某些氨基酸残基上接疏水的脂肪链，利用脂肪链牵引定位蛋白质于膜上。

（六）激光共聚焦技术

由于在细胞中，不同的亚细胞腔室结构将不同相关功能的蛋白质分隔在不同的区域，使用传统的酵母双杂交、pull down、Co-IP等方法均打破了这些腔室结构，使原本空间分布不同的蛋白质能够自由地相互作用，因而对蛋白质功能性相互作用分析带来了一定的假阳性率。在我们实验室的工作中，就曾经碰到过这样的现象，经过酵母双杂等方法检测结果都是阳性的两个蛋白，在完整的细胞中却完全无法共定位。为了确认这些蛋白质相互作用是否在细胞中真实存在，我们必须进一步地采用对两种蛋白亚细胞共定位分析的方法来进行确认。在蛋白亚细胞定位手段方面，传统的免疫电镜双标记方法虽然能够非常精确地反映不同蛋白在细胞结构中的精确定位，但是这种方法不仅技术上有一定困难，操作也相对复杂，并且需要很长的实验时间，实验成本也相对很高。而传统的免疫荧光标记的方法是通过用荧光标记的抗体来标记目的蛋白，虽然也可以得到细胞中蛋白的大致分布状况，但是得到的图像是整个细胞中荧光信号的叠加，得不到较高的分辨率，而且由于受制于倒置荧光相差显微镜的分辨率，这样的方法并不适合用于细胞内蛋白共定位的研究。此外，用荧光基团融合蛋白的方法也面临同样的问题。所以，建立在传统免疫荧光以及融合蛋白技术上的激光共聚焦技术验证蛋白亚细胞共定位已经成为研究者们的最佳选择。

1．激光共聚焦技术原理 共聚焦显微镜的原理在20世纪50年代就已经被人提出，而真正的激光共聚焦显微镜诞生于1987年。20世纪80年代以来，激光共聚焦技术不断发展完善，成为研究生物细胞内蛋白相互作用的一个强有力的新技术。与传统显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜采用激光作为光源，激发标记在目的蛋白上的荧光基团，采用共轭聚焦原理和装置并通过CCD来收集荧光信号，经过计算机处理从而得到单一层面或者多重层面甚至立体的图像。

激光器发出的激光束经过会聚透镜和针孔，在经过长通分色反射镜时光束偏转90°，然后经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质基团在相应波长激光的激发下沿各个方向发射特定波长的荧光，其中一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜，会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器CCD接收。这样只有在物镜的焦平面上发出的荧光才能够到达检测器，而其他位置发出的荧光均不能过针孔。由于不同的荧光基团其激发波长和发射荧光波长都有其不同的特性，通过用不同的激发光波长并采集不同波长的信号，就能够区分来自于不同荧光基团的荧光信号。因为物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，所以这种方式成像的显微镜被称为共聚焦显微镜。在激光共聚焦显微镜成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定了是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍荧光显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。激光依设定程序对样品被检区域进行逐点扫描，从针孔处得到该点的共聚焦图像，并进行记录。通过计算机分析来得到单一焦平面的高分辨率图像，这就为我们在镜下观测荧光标记蛋白的亚细胞的精确定位以及其与其他蛋白的共定位情况提供了可能。与此同时，我们可以通过设定程序由计算机控制的载物台升降来取得一系列焦平面上的图像信号，这样的数据被称为层叠图像（stack images）。这样的数据能够更为全面地描述蛋白在细胞中的定位，而且根据层叠图像，还可以通过计算机处理得到蛋白质在细胞中的三维分布图像，这样的表示方式更加直观生动（图7-9）。事实上，不同焦平面上信号的相互干扰还是能够对我们最后的成像效果产生不利的影响，最新开发出来的软件能够通过对层叠图像数据进行分析来消除这样的影响，得到更为锐化的图像，来为我们进行准确的判断提供帮助。有了清晰的图像，我们不但可以通过图像叠加直观地观察不同蛋白在细胞中共定位的情况，还可以通过计算机分析得到其共定位的数据，为进行比较提供了参考。

图7-9　激光共聚焦显微镜原理

在具体的实验工作中如何对目的蛋白进行荧光标记是我们实验的关键。实验步骤最简单而且成本最低的方法是在细胞中过表达与绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白YFP等荧光蛋白基团融合的蛋白，然后通过检测融合蛋白的荧光基团信号来检测多种蛋白在细胞中的亚细胞定位，从而得到不同蛋白的共定位信息。还有研究者通过对已有的荧光蛋白进行一系列的突变得到一系列不同颜色的荧光蛋白，为我们在研究中提供了更多的选择。但是由于最新的研究中发现，这些分子量较大的荧光基团会对蛋白质亚细胞定位产生一定影响，所以目前的趋势是传统的免疫荧光标记法更为研究人员所广泛使用。免疫荧光标记法使用不同荧光标记的抗体来识别内源性的蛋白质或者过表达的带标签（tag）的蛋白质来显示其在亚细胞中的定位。其中使用内源性抗体来对蛋白进行标记的方法更能反映在生理条件下蛋白在细胞中的真实分布。所以如果有高质量的抗体的情况下，我们应该首先选用这样的方法。荧光标记物可以通过化学交联的方法直接标记在一抗上，也可以通过荧光标记的二抗来识别一抗从而反映目的蛋白的分布。因为标记一抗对于大多数实验者有一定的难度，而且放大效率也不及荧光标记的二抗的方法高，所以我们在实验中通常采取先用一抗来识别内源性的蛋白质或者过表达的带标签的蛋白质，再用商品化荧光标记好的二抗来识别一抗的方法，来对目的蛋白进行标记。

2．激光共聚焦技术应用

（1）瞬时转染带小标签融合蛋白的免疫荧光定位法：由于过表达融合大型荧光蛋白基团的方法有可能会影响蛋白质的亚细胞定位，而在研究过程中，很多时候我们研究的是新基因而往往没有可用的抗体，所以瞬时转染表达的带较小标签（tag）的融合蛋白法经常被用来检测两种蛋白的共定位情况。常用的小标签有HA、MYC、FLAG、V5、His等，它们相对GFP等荧光基团有着很小的分子量（一般小于5ku），所以基本不会影响蛋白质在细胞中的亚细胞定位，而且都有相应的高质量商品化抗体能够高效特异地识别融合蛋白。它们的融合方式也有多种选择，一般HA、MYC、V5、His在常用载体中被融合在C端，而FLAG被常用载体融合在N端，在我们实验室的工作中，即使有的标签V5被放在蛋白质的中间区段，抗体都能够有效识别。具体的融合方式要根据不同蛋白质区段对细胞亚细胞定位的可能影响来选择，如生物信息学分析N端有信号肽的，就应该将标签融合在C端，如果相互作用发生在C端的就可以把标签融合在N端，在实验中我们发现事实上这类小标签对蛋白亚细胞定位的影响非常小，一般不会影响实验结果。而且在蛋白质功能的细胞和分子生物学研究工作中带着这些标签的融合蛋白表达质粒几乎一定会被用到，一般不用再次专门构建。需要提到的是，HA和V5市售抗体一般只有鼠源单抗，MYC、FLAG则可以买到鼠源单抗和兔源多抗。当同时使用两种标签蛋白的时候要注意抗体种属的适当搭配，以方便选用合适的二抗来进行标记。最常用的标记物为绿色的FITC（异硫氰酸荧光素）和红色TRITC（罗丹明）。

常用以下的表达克隆和抗体的组合来进行实验：Protein A-V5～mouse IgG-anti-V5～goat-anti-mouse IgG-TRITC；Protein B-MYC～rabbit IgG-anti-MYC～goat-anti-rabbitIgGFITC。其免疫荧光原理（图7-10）如下。

图7-10　免疫荧光原理

在激光共聚焦显微镜观察的过程中，先使用DAPI作为标记选取合适的焦平面。然后找到两种荧光信号都较强的细胞。注意：只有明亮的红绿信号才能认为是阳性信号，对其进行图像采集。因为激光共聚焦显微镜逐点扫描特定焦平面的各点，所以在目镜下弱的信号一般都很难被采集到，如果信号实在很弱，则需要改善染色的条件以满足观察的需要。可根据操作手册的指导来对条件进行优化，来取得最佳采集效果，一般的软件都给出了FITC和TRITC的预设置信息，如果采用特殊的标签，还应根据其激发特性来对图像采集进行设置。选中了目的区域后，建议采集层叠系列图片（stack images）作为数据保存，从有荧光信号开始，到荧光信号结束从纵轴上采集的一系列图像相当于对细胞进行了系列焦平面信号采集。这样虽然需要更多的时间来进行采集，但是得到的数据一方面可以用于制作3D图像，一方面还可以用于通过软件分析排除近邻焦平面上相关信号的干扰，还可以对于目标蛋白在整个细胞中的分布来进行分析。如果只需要一个图片也可以从一系列图片中选取最好的。通过软件分析来得到目的图片。一般需要给出红（TRITC）、绿（TRITC）、蓝（DAPI）3个通道的图像和重合的图像，并附上标尺，方便我们判断两种蛋白是否共定位。通过软件分析还能得到两种蛋白共定位的比例数据。

（2）使用抗体检测细胞中内源性蛋白的亚细胞定位法：在实际实验中，即使采用过表达标签抗体的方法，同样会遇到不能正确反映蛋白质在细胞中正确的亚细胞定位的现象。因为瞬时过表达的大量标签蛋白很容易聚集在内质网等蛋白加工修饰的亚细胞结构区域，这样的情况下，就会使我们对蛋白质的共定位不能准确判断。所以有必要使用抗体来检测细胞中内源性蛋白的亚细胞定位，这个方法实际操作相对来说是最简单的，也是最可靠的。关键在于必须要有针对细胞内源蛋白的高质量抗体。自己制备的抗体要进行Western实验确认识别条带的特异性，并经过免疫荧光染色的预实验才能够使用。即使是商品化的抗体，也有很多不适宜用来进行免疫荧光染色，因为由于蛋白质的折叠很有可能使被抗体识别的表位无法暴露，而在Western实验中蛋白质经过变性，则不存在这样的问题。商品化的抗体如果能用来做免疫荧光使用，则可以在说明书上看到详细的说明，有的还会给出参考图片以及使用过该抗体的参考文献，选购的时候要注意仔细参考对比，选取效果最好的。另外还要注意抗体的亚型和种属。一般最好选用IgG的抗体，因为针对IgM等其他亚型抗体的二抗使用不多，很多国内公司不提供，国外的价格又很高。两种不同的蛋白一抗必须来源于不同的种属，例如采用rabbit IgG anti ProteinA＋Goat IgG anti rabbit IgG（FITC）或mouse IgG anti ProteinB＋Goat IgG anti mouse IgG（TRITC）的组合方式。在共定位实验开始之前，有必要使用抗体对所用细胞株内源性蛋白进行Western检测，来确定两种目的蛋白在所选择的细胞株中都有内源性表达，并且要进行免疫荧光染色预实验来确保抗体可用。本方法中选择高质量的抗体和合适的细胞株是成功的关键。当然，也可以使用组织切片进行验证。

（3）基于亚细胞定位的活细胞内蛋白相互作用验证——荧光共振能量转移检测系统（FRET）：根据前述介绍的使用荧光融合蛋白标记验证共定位的方法，研究者们又进一步开发了荧光共振能量转移检测系统（FRET）法，用于验证细胞内的蛋白质相互作用，这种方法甚至可以在活细胞中进行。

对空间距离接近的合适荧光物质可以构成一个能量供体受体对（例如CFP／YFP），激发供体分子的能量传递给受体，而后受体发射光子。被不同荧光标记的两个蛋白，如果荧光基团供受体在合适的距离内（1～10nm），可以用供体的激发光激发，供体产生的荧光比原来单独存在时低很多，而受体产生的荧光则会大大增强，同时它们的荧光寿命也会相应缩短和变长。通过对这种效应在激光共聚焦显微镜下进行测定从而对蛋白质在细胞中的共定位以及相互作用进行确定。这样的方法同样存在荧光基团的分子量大小不可忽略的问题。由于通常使用过表达的荧光蛋白融合蛋白，经过体外实验验证相互作用的蛋白质内质网中的FRET假阳性很难避免。虽然可以通过一系列的对照来消除一些假阳性的信号，但是相对较高的假阳性率限制了FRET技术的广泛应用，虽然很多公司都提供了相应的宣传信息，但是在已经发表的有关蛋白质相互作用的研究工作中很少有报道。荧光基团间的距离也有可能成为制约FRET技术的因素，荧光基团的融合方式（N端／C端）也会对实验的效果产生影响。但是，对于一些弱的和瞬时的尤其是只在细胞甚至是活细胞内存在的相互作用，FRET技术则有着无法替代的优越性，随着技术的不断完善，相信一定会得到更广泛的应用。