酶免疫组化试验注意事项

在免疫共沉淀实验中应该注意以下几点。

1．抗体的特性 免疫共沉淀的使用的任何抗体应该是已经被明确定义的。也就是说，它应该明确说明可以从粗细胞抽提物中免疫共沉淀所对应的蛋白。有很多方法可以说明：①很多抗体，彼此独立地识别相同的蛋白和相同的肽段。②在没有目标蛋白的情况下，抗体不能识别目标蛋白。缺乏某种蛋白的细胞系可以来自具有癌症易感性个体的细胞系或基因敲除的小鼠。③将35 S标记的免疫共沉淀蛋白酶解后的肽谱与定义的cDNA体外翻译并被35 S标记的蛋白进行比较。如果细胞抽提物中沉淀的蛋白与cDNA编码的蛋白相同，肽谱也应该相同。

2．抗体对照 即使是小鼠的单抗也可能和不同抗原有非特异的相互作用。任何关于在免疫共沉淀物中可能存在相互作用的蛋白的推断都需要有特异性的抗体以及非特异结合抗体的对照。很明显，对照抗体和特异性抗体的特性越接近，越可以起到鉴定非特异相互作用蛋白的效果。对于一个小鼠的单抗，同一个亚类的另一个小鼠单抗是适合的抗体对照，对于兔血清，应该选择同一只兔子的免疫前血清，而对于纯化的兔多抗应该选用另一个纯化的兔多抗作为对照。

3．多种抗体 与抗体识别的主要目标蛋白相互作用的蛋白，而不是与抗体发生交叉作用的蛋白，也可能被免疫共沉淀下来。因此，如果多种抗体都可以免疫共沉淀同一种蛋白，那么复合体中存在特定相关蛋白的可信性将大大提高。同样地，免疫共沉淀复合物中的任何一个蛋白都应该可以观测到生理状态下的相互作用。这里存在一个问题，不同的抗体识别不同的抗原表位，一些表位可能隐藏在某一特定的蛋白复合物内部。相反地，一些抗体可能会影响复合体中某些蛋白的相互作用。因此，不是所有抗体都能共沉淀出相同的相关蛋白。

4．使用不表达目标蛋白的细胞系 除了非特异结合于抗体的蛋白，与共沉淀蛋白相关的蛋白在不表达目标蛋白的细胞系中应该不会被共沉淀下来。因此，如果可能的话应该用不表达那个目标蛋白的细胞系做免疫共沉淀的对照。

5．验证生物学相关突变 在功能上有意义的免疫共沉淀蛋白相关的蛋白可能在蛋白突变后就无法发生生物学的相互作用。因此，如果可能的话，应该检测免疫共沉淀蛋白与生物学失活突变蛋白的相互作用。这种突变可以是在特定的人细胞系中自然表达的（例如，肿瘤细胞中含有突变蛋白）或者可以是瞬时转染的带表位标签的突变蛋白。

6．验证相互作用发生在细胞裂解前还是裂解后 细胞裂解很大程度上影响细胞分区，细胞裂解后可能将正常状态亚细胞定位不同的蛋白拉近到一起。这样就提供了形成细胞裂解后非生理状态蛋白复合物的机会。理论上，可以通过在裂解缓冲液中加入可能的相互作用蛋白竞争裂解后的相互作用。

7．降低背景和非特异性相互作用蛋白 非特异性相互作用的数量或非生理状态下的相关蛋白可以通过优化免疫共沉淀的条件来减少。