质谱技术的研究中应用

质谱技术（mass spectroscope，MS）的原理是通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的研究技术。质谱仪通过测定离子化生物分子的质荷比便可得到相关分子的质量。质谱技术，作为一种高通量、高灵敏度地鉴别蛋白质复合物中各种成分的先进技术，广泛地应用于蛋白质组学的研究中。伴随着质谱技术的飞速发展，相应的样品准备即蛋白纯化的方法也不断涌现出来，如免疫沉淀、GST亲和纯化等纯化方法被广泛应用于蛋白复合物的纯化，继而通过凝胶电泳分离出各种组分，最后应用质谱鉴别。当然，为了达到高效和高精确度的鉴别目的，蛋白样本还需经过净化、蛋白酶解、肽键恢复等处理。本节将阐述如何正确和高效地进行用于质谱分析的凝胶分离相互作用蛋白的样品准备。

实验中首先应该注意的是要避免单用一种方法纯化，例如不要单用免疫沉淀的方法来纯化样本，尤其是目的蛋白大小在25～30ku和50～60ku的更不应该单用免疫沉淀法纯化，因为抗体的轻链和重链就在这个范围内。另外，在切胶消化时，抗体被消化产生的短肽会干扰质谱仪对目的蛋白的鉴定，因此应该把抗体交联到类似Sephrose的珠子上，从而降低干扰。在利用给融合蛋白加上标签进行纯化的方法时，选择合适的标签和适宜的漂洗液、洗脱液显得尤为重要。应该掌握的原则是在尽可能减少目的蛋白损失的同时将杂蛋白漂洗干净。另外值得注意的是，由于人为制造的融合蛋白不符合它的生理状态，与融合蛋白结合的杂蛋白可能导致目的蛋白复合物中某些成分的丢失或出现一些假阳性的蛋白成分。因此将标签蛋白切除后再增加一步纯化步骤就更好了，这也是为什么TAP方法比单纯的融合蛋白亲和纯化法优越的原因所在。

蛋白复合物在纯化之后，还需经过分离步骤才能进行质谱鉴定。研究蛋白质组学的技术路线有两条，一条是以双向电泳加生物质谱的方法鉴定生物体系中各种蛋白的表达谱以及各蛋白表达程度的相对变化，另一条路线就是多维色谱与生物质谱相结合的称之为鸟枪法的技术路线。目前双向电泳和多维色谱两条技术路线各具特色，彼此共存，其中的一种方法还不能完全取代另一种方法。

凝胶分离，顾名思义就是通过凝胶电泳的方法利用不同蛋白组分的电荷和质量等的差异进行分离，继而将有蛋白条带的胶块切割消化为肽段，进一步质谱鉴定。例如SDS-PAGE就是最常用的一维凝胶分离方法，它可以使蛋白组分的异构体、不同修饰和降解等现象一目了然。此外，2D凝胶电泳由于引入了等电聚焦的第二维，使蛋白分离得更彻底，灵敏度更高，因此被广泛地应用于质谱鉴定之前的蛋白分离。凝胶分离的最大优点是可以后续别的纯化和分离方法。非凝胶分离，如HPLC，则是利用离子交换色谱法将蛋白复合物分离，后续以ESIMS（electrospray ionization MS）鉴定蛋白组分。该方法最大的优点就是自动化完成性。凝胶分离和非凝胶分离各有利弊，需要结合具体的试验目的加以选择和利用。另外，二者可以很好地结合起来达到更好的纯化和分离作用。例如，通过切胶消化得到的短肽复合物经常混有盐、凝胶衍生物和其他一些杂质，如果直接进行质谱鉴定可能会影响其分辨率和灵敏度，所以需要去除这些杂质。可以利用液相色谱后续以ESI-MS的方法，也可以利用对上述杂质污染的样本依然有很高分辨率和灵敏度的MALDI（matrix assisted laser desorption／ionization）-MS的方法。

综上所述，合适的用于质谱分析的凝胶分离相互作用蛋白的样品准备是能够高效精确鉴定蛋白组分的重要前提，关系着整个试验的结局，是蛋白质组学研究中的精髓。

由于质谱的高灵敏度，轻微的杂蛋白污染就会导致整个鉴定过程的失败，如灰尘、头发和皮肤上的角蛋白及其他一些杂质会在胶上造成干扰背景，甚至影响质谱仪对目的蛋白的鉴定，所以样品的纯度很重要。在从蛋白复合物的纯化到凝胶分离相互作用蛋白，继而切胶消化为短肽的过程中，我们始终要掌握的原则是：简单、高效、经济、低损失、低污染。

凝胶电泳分离后的蛋白组分需要通过有效的方法染色才能充分切胶消化。能够后续用以质谱分析的染色方法有很多，其中最常用的就是考马氏亮蓝染色（考染法），但是它的灵敏度偏低，例如牛血清白蛋白（BSA）这样70ku左右的蛋白需要至少500fmol才能在凝胶上被检测到。银染的方法要比考染灵敏度高，例如BSA只需要125fmol就可被检测到。其余的染色方法还有Zinc acetate-reverse染色法、荧光染料染色法等。

将凝胶电泳分离后的蛋白组分切胶回收后，需要经过蛋白水解为短肽才能进行质谱分析。具有蛋白水解效应的物质有很多，例如溴化氰、盐酸、甲酸等，但是最常用的蛋白水解物是酶，因为酶具有高效性和特异性。例如很常用的胰蛋白酶，可以在赖氨酸和精氨酸残基的羧基端切断，形成大小在1～3ku的含有C末端的短肽，不但大小合适而且由于赖氨酸和精氨酸残基所带的正电荷有利于进行质谱分析。不过需要注意的是一些翻译后修饰和立体构象会妨碍酶的正常水解，造成水解不充分，生成一些较大的肽片段，影响后续的质谱分析。为了提高质谱分析的分辨率和精确度，常常会合用几种酶来进行蛋白水解，起到互补作用。较常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Asp-N和Lys-C等。

最后，要将质谱应用于蛋白鉴定就需要将蛋白混合物制备成气相带电分子，然后在真空中将其物理分解成离子。但是，如何使蛋白分子经受住离子化过程转成气相带电的离子而又不丧失其结构形状是个难题，所以质谱技术最初主要广泛应用于小分子蛋白质相互作用的研究。

近年，电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术的诞生使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。电喷雾质谱技术（electrospray ionizsation mass spectrometry，ESI-MS），是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m／z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液-质联用（LC-MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。基质辅助激光解吸附质谱技术（matrix assisted Laser desorption／ionization，MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight，TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。ESI-MS和MALDI-TOF质谱具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol（10～12）甚至fmol（10～15）的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。而且随着蛋白质的亲和纯化技术及其他一些方法，如“bottomup”等技术的进步，质谱在分离鉴定蛋白复合物组分方面的优势越来越明显，作用也越来越大。