胞内吞与小泡再循环

小泡的胞外排（exocytosis）释放其内含物，以此介导许多生物学事件，包括对脑功能必要的突触传递。胞外排之后，在几秒到几分钟内就发生胞内吞（endocytosis）以回收外排的小泡。经过对分泌细胞的数十年研究，发现有3种模式的胞外排，而与之相对应的有3种胞内吞模式：①全塌陷形式：在此情况下，小泡塌陷到质膜，膜内陷，小泡重新形成。②“吻和跑”（kiss and run，KR）：在这种形式下，融合孔开放，然后关闭。③复合胞外排：在这种形式下，出现巨小泡的胞外排。巨小泡是由小泡融合而形成的，然后发生大块胞内吞并回收巨小泡。本章讨论胞外排和胞内吞的3种模式以及它们在调节突触强度即量子大小方面的作用。由这种调节，产生了突触可塑性，维持了胞外排，清除了释放位点的小泡，保证了重新供给。还有一些近来的进展说明了小泡胞内吞是如何发生又如何耦合到胞外排的。提出的新模式是，通过电压依赖钙通道的钙内流，在钙微域附近触发胞内吞而且调节胞内吞速率；钙调蛋白和突触结合蛋白是钙的感知器；胞外排的分子机器包括SNARE蛋白，它对于同时发动胞内吞是需要的，有可能也调节胞内吞的量［7］。

3种胞外排随之以3种模式的胞内吞——经典胞内吞、“吻和跑”以及大块胞内吞。这3种形式的内吞保证在不同功能状态下有足够的小泡再循环（图3-4）。下文将介绍过去40多年来所积累的资料，说明从不同细胞类型中看到的各种模式的胞外排和胞内吞，以及它们实现功能的证据。讨论的焦点集中在神经末梢的胞内吞，在这里胞外排和胞内吞被研究得最为细致。此外，还介绍一些说明胞内吞如何发动并耦合到胞外排的近来进展，这是自20世纪70年代发现分泌小泡胞内吞以来的一个难题。有人提出胞外排与胞内吞的新的耦合模式，在此模式中钙信号传导通路和胞外排分子机器参与调节胞内吞的速率及数量［7］。

图3-4　胞外排和胞内吞及它们之间耦合的模式图（彩图见图版此处）

有3种胞外排（exo）模式——完全塌陷、“吻和跑”、复合胞外排，分别耦合到3种胞内吞（endo）：经典胞内吞、“吻和跑”、大块胞内吞。全塌陷融合也可以耦合到大块胞内吞（虚线箭头），但是此假说还有待验证。图也表示了每种胞外排模式在调节量子大小及产生突触可塑性方面的作用。？表示不清楚的功能或转变。（图引自［7］）

本节主要是从一般意义上讨论胞内吞问题，也包括了突触前神经末梢的胞内吞。但是就突触前神经末梢而言，还有其本身特点的问题。突触小泡再循环牵涉突触前神经末梢膜的回收与突触小泡的重新形成，此项研究虽然已进行了40年以上，但仍存在争议。看来是，除了钙离子以外，还有其他的因素参与其中，包括膜的张力、聚集在细胞表面的SV蛋白的数量和浓度，这些蛋白质也可能成簇成为“立即可回收池”［18］。另外有人认为，突触小泡回收和重新形成功能性小泡，可能是可以分开的过程［19］。再如，关于突触前末梢的突触小泡内吞，最近有研究表明，在生理性温度下应用时间分辨的突触前膜电容测定方法，测定了经内吞的融合突触小泡的膜回收，发现在成熟的中枢神经元里，单个动作电位就可以触发快速的、网格蛋白不依赖的小泡内吞。这种快速内吞不依赖于网格蛋白，但需要有发动蛋白（dynamin）和肌动蛋白参与；较强刺激所诱发的内吞，其时程较长［20］。

1．全塌陷融合

关于这种模式的提示，主要源于电子显微镜冰冻折断实验。实验发现了直径约为60～120 nm的小泡样结构，比常规小泡直径（30 nm）要大；又发现，神经-肌肉接头受刺激以后，这种60～120 nm直径的小泡更为丰富。其他证据是间接的，也支持这种融合模式。例如分泌细胞，包括神经末梢的细胞接触记录显示膜电容增大。由于单个小泡融合伴随有融合孔电导的增加，这就反映了小孔的扩大。小孔直径可增大到很高的值，甚至超过检测范围（约4～6 nm），而且在数秒钟不伴随有下行步幅。此现象提示了快速的小孔扩大。用电流测量法测定来源于小泡释放的儿茶酚胺，以及用成像法测定荧光标记的小泡蛋白质和脂质，这些研究都发现，有快速释放的动力学存在，提示有较大的融合孔或者有孔的扩展。让直径为15 nm的量子点预先负荷突触小泡（就是使量子点进入小泡内），这种量子点可以被释放，提示融合孔要大于15 nm。虽然上述证据已经使我们大家能够接受全塌陷模式，但仍需要直接观察活细胞里面的这种形态学变化。这看起来是有可能的，因为我们已经有了新开发的超分辨影像技术了［7］。

2．“吻和跑”

“吻和跑”（KR）是一种非常规的、突触小泡膜与质膜之间的融合过程。此时小泡形成一个短暂的、纳米级的融合小泡小孔，把小泡内容物排出至细胞外。但这种融合小泡仍然保持其大体形状，并不完全合并到质膜；仍然保持有足够的内容物，以便很快回收，并使其内容物重新酸化而被应用。学术界认为这一过程对突触的信息传递是有影响的［21］。这里仅简单介绍有关“吻和跑”的证据。原来的建议是根据在神经-肌肉接头电子显微镜图像上看到的Ω剖像（profile），但是对于所看到的Ω剖像究竟是中间结构塌陷还是孔关闭，并不清楚。第一个有说服力的证据来自测量到的电容闪烁（flicker）。有时候在对分泌细胞包括神经末梢的电容测量中，可以测量到一个孔的电导（相对比较狭窄的孔，大概为0.5～3 nm的直径）。细胞接触的电容测量记录以及电流测量记录都显示，有时电容闪烁可伴有独立的脚样波动；在电流测量中，这种波动可以在嗜铬细胞和PC12细胞上看到。提示“吻和跑”的证据还有：有时可能部分地释放递质。在嗜铬细胞或含胰岛素细胞里荧光标记小泡膜或者小泡腔内的蛋白质（如phogrin或plasminogen），可以看到它们成簇地融合，再成簇地被回收，历时几秒或几分钟。这体现了比较慢的“吻和跑”模式。从影像学资料方面看，在小的突触上，如培养海马的突触及八目鳗的网状脊髓神经元的突触，也有资料提示存在“吻和跑”模式。例如，FM染料(4)的部分释放和突触pH荧光素（synapto-pH luorin）的快速增加或减少，这些都可能反映融合孔的短暂开放与关闭。特别是近来用含有量子点的小泡做实验，发现在胞内吞和胞外排过程中，并不释放约15 nm的量子点。但是，也有其他影像学的研究发现并不符合这种提示。所以，关于“吻和跑”模式代表了相当百分比的突触胞内吞和胞外排这一点，还不是被普遍接受的［7］。

3．复合胞外排

电子显微镜资料显示，在腺细胞里面有多小泡的结构。这提示了小泡与小泡可以互相融合。对肥大细胞及嗜酸性白细胞的电容测量表明，上行步幅的增大可以超过正常小泡的膜电容，提示有已经通过小泡融合实现的、非常大的融合小泡存在。在嗜酸性白细胞里，规则性的小泡直径大约为1.7 μm，但有相当于几个小泡膜电容的上行步幅电容，伴有释放荧光标记的多个小泡。在胰腺腺细胞中通过荧光成像方法看到，在一个已经融合但还未塌陷的小泡膜上可以看到融合，被称为次序性复合融合［7］。

复合胞外排在非神经细胞中已经很好地被确定。这种小泡大小约为300～2000 nm，而近来有关突触的实验结果提示，突触小泡一般只有20～50 nm。从机制上讲，突触小泡的融合是有可能的，因为小泡具有为胞外排所必需的小泡和膜靶向的SNARE蛋白。在离体条件下，由突触体分离的小泡可以互相融合。在丝带突触上，刺激后可以立即看到大的小泡结构。如同正常小泡一样，这些大的小泡结构也通过细纤维连接到丝带上面。以上情况提示，大的小泡可能是经过小泡融合而产生的。在萼突触上，经由释放面的细胞接触电容测量发现，电容上行步幅可以10倍于正常的小泡电容。此种大的上行步幅不是由于同时或先后次序的多个小泡融合，其理由是：①它们的上升是立即的，0.6 ms的时间就够了；②它们不仅产生在刺激当时，也产生在刺激之后，此时并没有引起同步释放的去极化；③有时候它们伴有融合孔电导的增加，这反映了融合小泡孔的扩大。大上行步幅的电容与电子显微镜底下看到的巨小泡相伴，而电生理实验又在突触后神经元上记录到巨大的小兴奋性突触后电流（miniature EPSC，mEPSC）。这些结果都提示了复合胞外排的存在。萼突触的胞外排，在去掉细胞外钙或去掉钙感知器突触结合蛋白以后，与外排相伴随的巨电容上行步幅、巨小泡以及巨mEPSC都不再出现。这提示，跟正常融合一样，钙与突触结合蛋白的结合触发了复合胞外排［7］。

这里只讨论经典胞内吞与大块胞内吞，因为“吻和跑”已经把胞外排和胞内吞连在一起了［7］。第一次提出胞内吞是基于电子显微镜观察。在受刺激的蛙神经-肌肉接头上，看到胞内吞样的中间体，包括浅的或深的膜凹陷、包被的（coated）和不包被的陷窝。要是缺少参与包被依赖胞内吞的蛋白质，如两亲蛋白（amphiphysin）、吞蛋白（endophilin）、AP180、辅助蛋白（auxilin）和发动蛋白（dynamin）等，这些中间体可以在神经末梢积累起来。此外，网格蛋白（clathrin）、AP2和stonin2蛋白的基因敲除可以延长胞内吞。另外，用药理学方法阻断参与包被依赖的胞内吞，用基因敲除方法敲除吞蛋白、辅助蛋白等，均可延长胞内吞。在垂体神经末梢及萼突触，反映单个小泡分裂的电容下行步幅在前几秒内并不伴有同样大小的上行步幅，提示有经典胞内吞的存在，但是没有“吻和跑”的胞内吞。这些事实导致大家广泛接受一种看法：在分泌细胞中有包被依赖的经典胞内吞。如果能够在活细胞中看到实现这种经典胞内吞的动态结构变化，将会为这个问题提供目前尚未具备的关键证据［7］。

通过强烈刺激神经之后的电子显微镜实验，发现有大于正常小泡的内小体样结构或者潴泡（cisternae）结构。某些结构可以把细胞外的辣根过氧化酶或FM染料吸收入内，提示其胞内吞的起源。影像学研究发现有大的荧光点，可能对应于摄取了细胞外染料的内小体样结构。这种结构的产生有两种可能性，一是由大块胞内吞产生，二是由小泡融合产生。第一种可能性是根据电子显微镜实验，某些内小体样结构是由质膜凹陷产生的，特别是在抑制胞内吞的条件下产生的；但也不排除，膜的向内深凹陷是正常小泡分裂的一个框架。第二种可能性是小泡融合，这在20世纪70年代就提出来了。近来的提出是根据一些实验：在离体情况下，从突触体中分离出的胞内吞小泡，可与其他小泡互相融合，或与从PC12细胞得到的其他胞内吞体融合。为了确定这种大块胞内吞是否发生，可能需要在活细胞里面把大的小泡抠下来。电容测量技术提供了一个研究方法，可用来测定抠下的大块小泡［7］。

在毫秒级水平上测量萼突触的全细胞膜电容，发现电容下行步幅可大于20 fF（20×10-15 F），比正常小泡的电容（0.07 fF）要大得多。这种大的下行步幅伴有分裂孔电容的减少，反映有的孔在关闭，从3～19 nm直径开始，速度约为4 nm/100 ms。这样看来，电容测量上的大下行步幅，反映了大块胞内吞。在含有致密轴心小泡（dense-cored vesicle，DCV）的垂体细胞和非神经元细胞，也可看到大的全细胞下行步幅。这种全细胞记录的缺点是，只能够分辨那些反映约0.8～4 μm直径小泡的巨大下行步幅。这还是太大，远远大于20～50 nm的突触小泡。这个缺点可以用细胞附着（cell-attached）记录方法来弥补，后一种方法可以演示萼突触的释放面下行步幅到0.02～3 fF，相当于20～330 nm的小泡。某些大的、细胞接触的下行步幅伴有分裂孔电导的减少，反映了大块胞内吞后的快速孔关闭。总起来看，全细胞及细胞附着的膜电容测量结果表明，其大小范围把内小体样结构也覆盖在内，而且表明存在着大块的胞内吞过程，特别是当强烈刺激的时候［7］。

对蛙和果蝇的神经-肌肉接头研究发现，在作为神经毒素的黑寡妇蜘蛛毒素引起钙不依赖的释放以后，辣根过氧化物酶或FM染料可以被小泡摄取；去掉细胞外钙以后，染料的摄取就减少。因为电压依赖的钙通道（VDCC）是不激活的，所以此实验提示，细胞外钙调节着胞内吞。然而，因为染料摄取是在钙不依赖的胞外排以后测量的，所以仍不清楚，这种结果是否可应用于生理上钙依赖的胞外排之后的那种胞内吞。比较两种条件下突触体标本的FM染料释放：一种是预先以FM染料负荷并存在着细胞外钡的，另一种是预先以FM染料负荷并存在着细胞外钙的。实验表明，前者的FM染料释放减少。这提示，细胞外钙可以调节小泡周期中的某个步骤，例如胞内吞，小泡动员到存储池，或者小泡释放的概率。为了确定细胞内钙是否调节胞内吞，用透析法把0.5～1 μmol的钙透析到金鱼视网膜神经末梢，发现透析可抑制胞内吞。但以后的研究显示，钙内流易化胞内吞。在海马突触上，增加细胞外钙——因此也就增加了动作电位发生时的钙内流，可以加快由动作电位引起的慢胞内吞；在视网膜神经末梢，透析给予钙缓冲剂EGTA，可延缓快速胞内吞；在毛细胞，发现在高钙浓度环境中更容易出现快速胞内吞，这个高浓度是用去笼囚方法获得的；在嗜铬细胞，把细胞外钙用钡取代之后，就阻断了快速胞内吞［7］。

纵观用全细胞记录方法在萼突触上所得的实验结果，有5个方面的证据提示，钙内流触发所有形式的胞内吞——慢速的和快速的，还有大块胞内吞、胞内吞超射。①细胞外钙从5 mmol减少到0.25 mmol，可以减少钙电流及慢胞内吞率，减少50倍。②10 mmol的钙快速缓冲剂BAPTA减少胞内吞速率，可减少1000～1500倍，而1 mmol的BAPTA减少由串动作电位所引起的慢胞内吞。③当钙电流电荷增加时，胞内吞的初始速率可以增加好多倍。例如在接近静息条件下的萼突触，钙浓度为0.5～0.75 μmol，胞内吞的时间常数τ约为600 s；用10个2 ms的去极化脉冲，以10 Hz的频率进行刺激，可以引导胞内吞，其τ约为15 s，而10个50 ms的去极化脉冲，可诱导大的钙电流电荷及胞内吞，其τ约为1 s，因此胞内吞的τ可以减少近600倍，依赖于钙内流。这3组实验提示，钙内流触发快的和慢的胞内吞。④强力刺激增加大电容下行步幅的出现频率，表明大块胞内吞减少10倍。频率增加依赖于钙电流的电荷。70 nmol的EGTA可以基本上全部取消此种增加，而且减少分裂孔的关闭时间，从100 nm/s减少到10 nm/s，这是根据估计分裂孔的电容测量而得到的。这些结果提示，钙内流触发了大块胞内吞。⑤当细胞外钙从1.3 nmol增加到10 nmol时，由强刺激引起的钙电流电荷及胞内吞超射的频率可以从0到100%；而10～70 nmol的EGTA可以取消胞内吞的超射。这就提示，钙内流触发了胞内吞的超射。以上是5组实验的证据［7］。

有3组实验提示，慢胞内吞的触发需要微米/纳米范围中几个毫摩尔的钙。①在0.5～0.7 mmol钙浓度下的胞内吞是非常慢的，其τ约为600 s。②EGTA可以减慢胞内吞，而快速钙缓冲剂BAPTA可以取消胞内吞。这个结果提示，类似胞外排对于EGTA的敏感度，靠近钙通道微域的钙内流不仅触发胞外排，也影响胞内吞。这个微域的钙浓度大于10 μmol。当萼突触成熟的时候，由于钙和胞外排的耦合以及钙和胞内吞的耦合，其微域从微米转变到纳米数量级。③用光分解方法使笼囚钙释放，当钙浓度超过10 μmol时，可以诱导胞内吞。这些结果提示，胞内吞的触发是在靠近小泡释放的部位，这就挑战了一个似乎确定的看法，即胞内吞是在活动带周围区发生的。实际不是这样。与此提示相一致的是：蛇神经-肌肉接头FM染料的摄取是靠近活动带的，海马终扣质膜的可回收的小泡池被认为在活动带周围约100～300 nm的范围内，果蝇神经-肌肉接头的包被蛋白可能位于活动带附近，PC细胞(5)的胞内吞位点大约在胞外排部位500 nm的范围内［7］。

虽然胞外排的量并不调控胞内吞的速率，但是电容测量的增加或者蛋白质标记的小泡pH荧光素信号的增加，通常随之以基线的下降，表明在胞外排量和胞内吞量之间存在着匹配关系。当用肉毒毒素把SNARE蛋白裂解以后，胞外排就被取消了，因为这个蛋白质对于胞外排是必需的。毒素作用以后，虽然钙内流仍然引起强的去极化，可是没有胞内吞发生。由此可见，为了胞内吞的发动，除钙内流以外，胞外排也是需要的，胞外排可能调节胞内吞的数量。一个显然的例外是胞内吞的超射，但它仍然可能需要胞外排，因为胞内吞的超射可以回收小泡，即原来融合的小泡，它搁浅在质膜上［7］。

早期研究提示，小突触小泡蛋白可能参与海马突触的快速胞内吞，虽然当时检测快速胞内吞的技术是有争议的。近来的研究显示，在萼突触上，破伤风毒素可以裂解小突触小泡蛋白，阻断慢的胞内吞。这提示小突触小泡蛋白参与了慢的胞内吞。近来的一个研究又发现，破伤风毒素不仅可以阻断快的胞内吞，也阻断萼突触的慢的胞内吞。肉毒毒素分解了突触融合蛋白或SNAP-25，也可以阻断萼突触的快的和慢的胞内吞。此外，在培养的海马突触，基因敲除小突触小泡蛋白或者SNAP-25可以抑制慢的胞内吞。总的结论是，在萼突触和海马突触，所有3种SNARE蛋白都催化胞内吞，参与快速的和慢的胞内吞。既然在所有的神经末梢和分泌细胞，SNARE蛋白都介导胞外排，那么SNARE蛋白的双重作用可能是一个普遍性原理［7］。

至于SNARE蛋白如何参与胞内吞，还不清楚。结合研究可以提供一些线索，例如突触小泡蛋白结合到胞内吞接头蛋白AP180和CALM（包被蛋白组装淋巴性白血病蛋白）的ANTH域，SNAP-25可以结合胞内吞蛋白，突触融合蛋白可以结合发动蛋白，等等［7］。

前面介绍了发动胞内吞的双重条件（图3-5）：一是钙内流激活钙调蛋白和钙结合蛋白，二是胞外排的分子机器包括3个SNARE蛋白。比之单独一个条件，双重需要应该是更有利和更经济的。例如，如果钙内流是唯一的单个需要，像在许多低释放概率的突触里就会发生这种情况，即在动作电位诱导钙内流而不能诱发胞外排时，但钙内流仍可引起胞内吞，这将导致神经末梢的皱缩。不过假如是双重需要，胞内吞及神经末梢的皱缩可以被阻断，因为既需要钙，也需要胞外排，而胞外排并未发生。同一个SNARE蛋白，它参与胞内吞也参与胞外排。这种分子可以携带信息，包括胞外排的量，也可以提供一个机制，介导胞外排和胞内吞的耦合。所以，这种双重功能是非常有效而合理的［7］。

图3-5　介导胞外排和胞内吞耦合的图解

显示有两条通路介导胞外排和胞内吞的耦合：a．钙内流激活钙调蛋白及/或突触结合蛋白；b．SNARE蛋白（小突触小泡蛋白、SNAP-25及突触融合蛋白）。（图引自［7］）

现在已有人提出一个工作假说，其要点是，钙内流和SNARE共同介导胞外排与胞内吞的耦合。关于小泡胞外排和胞内吞的机制，特别是后者，有这样几个要点。

①3种模式的胞外排：全塌陷的融合、“吻和跑”、复合胞外排，调节胞外排的量及强度。通过它们，突触可塑性可以产生。

②3种模式的胞内吞，经典的包被蛋白依赖的胞内吞、“吻和跑”以及大块胞内吞，调节胞内吞的速率和容量，从而可以在不同刺激条件下维持胞外排。

③胞内吞不仅使小泡循环，也通过活动带的清除，介导了钙介导的、把小泡充实到可释放池的过程，这可以帮助由于重复放电而发生的短期突触阻遏的恢复。

④有3种大小匹配的胞外排和胞内吞的耦合。第一种是全塌陷的整合和经典的胞内吞，第二种是“吻和跑”，第三种是复合的胞外排和大块胞内吞。

⑤通过质膜电压依赖钙通道的钙内流，以微米/纳米数量级的维度触发全细胞水平所有形式的胞内吞，钙调素是主要的钙感知器，突触结合蛋白也参与其中。

⑥胞外排和SNARE蛋白的3个组成部分对于胞内吞的发动是需要的。

⑦钙的信号转导通路和胞外排的分子机器，可以在时间和数量上介导胞外排和胞内吞的耦合。

⑧这里所描写的分泌细胞的小泡胞外排和胞内吞耦合的原理，可能对于蛋白质和小泡的运输有更广泛的影响［7］。