乙酰胆碱受体

生物化学历史上的一个关键性事件是首个神经递质受体的鉴定，即烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的鉴定。为了鉴定它，多个学科的手段被广泛地运用，如电生理学、药理学和生物化学。多学科集合在一起，以一个统一而合理的方法、共同的目标，成功地鉴定了一个分子。神经系统中的这个nAChR分子可以把化学信号转变成电信号。此受体是更广泛的五聚体膜受体大家族的一员，也是最重要的一员。鉴定nAChR为鉴定GABAA受体等其他的受体铺平了道路［8］。

nAChR的首次分离是1970年的事情，当时它的来源是电鳗电器官。这是第一个配基门控离子通道，也是被鉴定的第一个离子通道。其后25年，许多其他的受体——GABAA受体、甘氨酸受体以及它们的亚单位，都得到了克隆而且被测定了顺序，同时它们与nAChR的同源性被认识。nAChR发现之后5年，与它非常接近的、存在于原核细胞的同源配基门控离子通道也被阐明。本章将介绍发现nAChR的几个主要步骤［8］。

1905年，在神经-肌肉标本上做研究的英国生理学家J. N. Langley提出，肌肉组织含有一种物质，此物质可与烟碱或箭毒结合，它接受刺激而且传递刺激。Langley称肌肉上的这个实体为“接受物质”。往后的50年，药理学上的“受体”概念鼓舞了3个主要方向的研究。第一个方向是采用药理学方法，应用新的化学配基，特征化（characterize）受体部位的特异性，例如区分了烟碱型（n-）和毒蕈碱型（m-）的乙酰胆碱受体（AChR），像戴尔等人的工作。第二个方向是以卡茨、埃克尔斯等人为代表的电生理学研究工作，其目的在于了解内源性神经递质信号所引起的离子反应。第三个方向是化学性研究工作，其传统目的在于鉴定受体的分子构成［8］。

20世纪60年代后期，脂质、多糖、蛋白质甚至核酸都曾被认为是可能的受体。第一批独立的工作是由C. Chagas、E. de Robertis、D. Nachmansohn等人做的，他们企图鉴定电鱼（Electrophorus electricus）电器官里面的乙酰胆碱受体，方法是用放射标记配基。但是此方法以后被放弃了，因为在组织提取后缺少特异性。在研究过程中Nachmansohn认识到，电器官中有非常丰富的乙酰胆碱受体，因此这个标本是可以利用的。他和E. Schoffeniels一起设计了方法，从电器官里面制备个别细胞、个别电板。这种方法提供了在同一生物学标本上同时进行电生理学、药理学、生物化学研究的可能性。那时候有推测认为，乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和介导乙酰胆碱生理反应的受体，可能存在于同一蛋白质复合体上［8］。

这是一种新的生物化学方法，它的引入从根本上改变了受体鉴定领域。亲和标记法的原理是应用一种化合物，在结构上它是神经递质同源物，也具有同样的高反应性基团。这个探针化合物可以特异地结合于受体的位点，而且以共价键方式连接到蛋白质上。例如，有一个分子叫TDF（p-trimethylammonium benzenediazonium fluoroborate），它具有三甲铵（trimethylammonium）基团和重氮基团，而三甲铵是类似乙酰胆碱的。如所预期，TDF可与电板起共价键反应，而箭毒以不可逆竞争性拮抗剂的方式，保护其不受共价键的结合。后来，这个亲和标记方法又有改进。然而当时的组织制备方法以及化合物特异性，均不足以达到从电器官里面分离出受体的要求［8］。

显著推动此领域的另一个方法学是改变操作流程，成功地实现富含AChE的电器官膜片段的分馏与纯化（fractionation and purification），而在电子显微镜下又发现了这些膜片段上有密集的小泡。在细菌透酶（permease）技术的鼓舞下，一个简单的过滤技术使人们有可能测定通过小微囊的放射性钠和放射性钾的流动，而此微囊可以对激动剂乙酰胆碱起反应，并具有特异性。这非常类似于从完整电板记录下来的电生理反应。信号转导过程是由神经递质发动的，而且可以在完全无细胞系统、在化学界定的环境中重现，不需要能量供给。有了这些条件以后，已经有可能研究离体条件下由乙酰胆碱所引起的生理反应，以及所引起的信号转导机制。受体分子显然存在于纯化质膜上，而且处于有功能的状态。于是，有可能应用放射配基来追踪这种纯化的膜与烟碱型激动剂十烃季铵（decamethonium）的可逆性结合（图3-6）。去垢剂脱氧胆酸盐可以温和地提取结合蛋白而不引起它变性，结合十烃季铵可以被不同的烟碱拮抗剂所取代，根据拮抗剂的生理效应强弱，有箭毒、三乙碘化三（β-二乙氨乙氧基）苯（flaxedil）等。从此以后，类似的受体结合检测方法被广泛地用来特征化GABAA受体和甘氨酸受体等［8］。

图3-6　鉴定烟碱型乙酰胆碱受体

（a）运用鉴定烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的平衡透析法做结合实验的方法；（b）蛇毒毒素α-BGT对烟碱型激动剂的十烃季铵进行氚标记之影响。（图引自［8］）

来说说蛇毒毒素的应用。中国台湾药理学家李镇源（Chen-Yuan Lee）发现，有一种蛇毒毒素——α-环蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）可以特异地阻断高等脊椎动物的神经-肌肉传递，其作用是在突触后水平，不与AChE相互作用。当李镇源偶然来到巴斯德研究所访问时，J. P. Changeux想起了贝尔纳（C. Bernard，1813—1878）的一个看法。贝尔纳认为，毒性物质可用作为化学解剖刀。Changeux向李镇源提出：能否给他一个包装的毒素？几天后他得到了这个毒素，并立即在前面讲过的那3个系统中进行了试验。结果非常明显：①α-BGT阻断在体电反应；②α-BGT阻断离体微囊对烟碱型激动剂的离子流动反应；③α-BGT也阻断放射标记十烃季铵与去垢剂提取物的结合。这个提取物中实际上含有一种蛋白质，它对蛋白酶消化敏感，可与烟碱型激动剂及蛇毒毒素结合，结合是通过相互排斥的方式。这个nAChR分子被发现是高分子量的疏水性蛋白质，可与AChE从物理上区分开来［8］。

眼镜蛇的α-蛇毒密切地同源于α-BGT，把眼镜蛇毒以共价键方式耦合到琼脂糖珠（bead）上，并不丧失其结合活性。把含有毒性的珠和膜制备混合后，发现75%～100%的乙酰胆碱受体蛋白结合到了毒素珠上，而85%～100%的AChE仍保留在上清液里。此结果证实，AChE和乙酰胆碱受体分子是两个不同的蛋白质实体。该研究也把亲和层析技术引入nAChR研究领域，Changeux等许多研究组知道了这样一种明确的方法学。多个研究组应用了不同的亲和柱，应用了固定的季铵激动剂或拮抗剂，这样就扩展了应用范围（图3-7）。R. Miledi等应用了放射性131I标记的α-BGT。他们认为，碘标记的α BGT选择性地结合于静息状态的受体［8］。

图3-7　通过亲和层析法纯化烟碱型乙酰胆碱受体（图引自［8］）

回过头来看，另一项技术发展虽然比较简单，但对烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）研究有着重要的影响，那就是从电鳐（Torpedo）电器官匀浆中分离出了新一代具有兴奋性的微囊，它含有非常高浓度的nAChR，可高达总蛋白质的20%～40%。这个发现很快得到其他研究组的证实，这种含丰富乙酰胆碱受体的膜制备完成以后，就能对膜上乙酰胆碱受体的结构和功能特点开展一系列生物物理学研究。例如在大量纯化以后，可应用荧光光谱学、电子旋转共振方法、X射线衍射方法等进行研究［8］。

最后，从电鳗也从纯化的含丰富nAChR的电鳐膜上，得到了纯化的nAChR蛋白质。在电子显微镜下考察这两种膜制备时发现，里面有像环一样的颗粒，颗粒直径约8～9 nm，它有一个亲水性轴心，周边围绕着由5～6个亚单位组成的致密束，形成一种紧密包装的二维结合物。在电鳐突触后膜上，约有8000～12000 μm2的面积（图3-8）。这些nAChR图像是有关神经递质受体的第一个图像，以后被更详细地描述。此后也获得了其他受体的图像，如GABAA受体、甘氨酸受体等［8］。

图3-8　首个用电镜观察到的纯化电鳗乙酰胆碱受体的蛋白质结构和来自电鳐的纯化突触下膜片段

（a）纯化电鳗乙酰胆碱受体的蛋白质结构；（b）来自电鳐的纯化突触下膜片段。200 Å＝20 nm。（图引自［8］）

纯化烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的含量，已经足够用于鉴定受体的亚单位组构。第一个研究是用纯化的电鳗nAChR进行部分交互链接。研究发现，有5个明确界定的条带提示了五聚体的组构。此结果很快被其他实验室所证实。A. Karlin实验室额外地发现，nAChR分子由4个不同类型的亚单位组成，而分子质量稍微有些差别，即2个α、1个β、1个γ、一个δ，即所谓的异五聚体［8］。

关于亚单位的化学如何，当时一点也不知道。运用近来发展起来的高分辨微量测序技术（microsequencing），仅需少量的蛋白质即可测定氨基酸顺序。于是Changeux实验室鉴定了电鳐的nAChR，发现它以20个氨基酸的序列组成α亚单位的N末端域。然后，成功地得到了受体的化学名片。这是第一个建立起来的神经递质受体名片，以后被其他实验室所证实。他们用的是电鳐受体的α亚单位，并且扩展到4个亚单位的N末端顺序，发现了各个亚单位上氨基酸顺序的一系列特征。与Monod-Wyman-Changeux 1965年的模型相一致，nAChR蛋白是一个真正的寡聚体，它的对称性是假的，拥有垂直于突触后膜平面的5个旋转轴［8］。

有了氨基酸顺序的材料，就开启了对nAChR领域的新认识。现在就可以应用重组DNA的技术了。日本的S. Numa研究组、美国的S. Heinemann及E. A. Barnard，还有许多其他实验室的工作者，他们努力克隆来自电器官及肌肉nAChR不同亚单位的cDNA，并确定其全部顺序。Barnard、Miledi等的实验证明，如果把从电鳐电器官中提纯的信使分子注射到非洲爪蟾卵细胞，可导致卵细胞膜上出现功能性的乙酰胆碱受体，这样就可以用卵细胞做电生理实验；注射克隆的4种mRNA的转录分子，可以产生具有功能性的nAChR。这证实了早期生物化学实验所演示的：4个类型的亚单位就足可以组装成为具有工作能力的完整nAChR［8］。

考察nAChR的完整cDNA顺序时发现，沿着亚单位顺序有几个共同的结构域，这样就导致了nAChR亚单位的第一个跨膜组构模型。人们建议，nAChR有1个长亲水性N末端，有4个疏水性段，还有1个短的亲水性片段。它们分别组织成细胞外（突触）域、4个跨膜α螺旋、1个细胞内（也就是胞液的）域。1986年及以后，知道了神经元的nAChR（包括α7 nAChR、α4β2nAChR），还有GABAA受体、甘氨酸受体、3型5-羟色胺受体（5-HT3受体）、谷氨酸门控氯通道（glutamate-gated chloride channel，GluCl）等分子。它们有很接近的同源性顺序及亚单位组构，都含有一个CYS环。这些受体加在一起，就组成一个五聚体受体超家族，而这是Changeux经典研究的对象。近来在原核细胞中发现了直系同源基因的阳离子通道，使超家族扩大了。它的进化起源提早了300万年［8］。

乙酰胆碱受体蛋白及其不同位点的真正三维结构拓扑学，仍不能运用重组DNA的技术直接加以推定。对组成乙酰胆碱结合位点的氨基酸，以及对离子通道进行鉴定需要依赖不同的技术。例如，以前曾经提到过的亲和标记法在这个阶段也可以是有用的。首个结果来自A. Karlin，他们用4-N-马来酰亚胺苯基三甲胺碘盐（N-maleimido phenyltrimethylammonium iodide），后者可以标记乙酰胆碱结合位点的巯基。这个亲和结合方法导致了对于一对靠近的半胱氨酸之鉴定，其位置在氨基酸192、193，位于α亚单位的N末端域。然而，有关乙酰胆碱结合位点的药理学特异性仍然不清楚［8］。

Changeux研究组证明，蛇毒的氚标记α-蛇毒本身，不需要增加修饰就可用作光标记，用紫外光照射氚标记的毒素-受体复合体并予以光照后，可导致合并的共价键结合放射活性不仅进入α亚单位也进入γ和δ亚单位。他们根据此观察得出结论，乙酰胆碱结合位点是在亚单位界面上，因此是非相等的（non-equivalent）。这个结果在以后的功能研究上也得到了证明［8］。

p-N，N-二甲铵重氮苯正离子硼酸盐（p-N，N-dimethylammonium benzenediazonium difluoroborate，DDF）是类似TDF的一个亲和探针，应用它得到了重要的信息。DDF的二甲铵基造成共振分子，从蛋白质转移过来的能量可以激活它。的确，发现了有8个氨基酸可被DDF标记，其中6个具有芳香族侧链，所有8个都位于α亚单位N末端的长疏水性域。这些氨基酸分布为3个环，它们形成带负电的芳香族基团口袋，位于单个主要环上，而乙酰胆碱季铵就待在这个口袋里面。这样，它类似于AChE的结合位点。AChE的结合是π键结合。这3个环位于α亚单位的侧面，以后被称为“主成分”，并分别称为A、B和C。这3个名字的命名是得到受体研究界公认的。与氚标记α-蛇毒的光亲和标记资料相一致，除α亚单位以外，亲和探针DDF也可以标记γ、δ亚单位。Karlin、J. B. Cohen还有Changeux研究组的研究证明了这个看法，又额外鉴定了D、E和F环，它们位于界面的非α亚单位侧面，被称为“补充”成分。这些生物化学资料还受到标记氨基酸的位点突变研究的支持［8］。

结合位点组构的证明，也来自对蜗牛可溶性蛋白质的三维结构研究。该蛋白质可以结合乙酰胆碱，它是乙酰胆碱结合蛋白，但不是乙酰胆碱受体。不过，它具有想象的、同源的胆碱受体的细胞外域，相当于真核细胞GluCl受体，以及原核生物欧文氏菌（Erwinia chrysanthemi）的与GABA结合的受体，乙酰胆碱是它的拮抗剂［8］。

20世纪80年代早期还没有任何关于离子通道方面的生物化学结构资料。当时的问题是，如何从化学上鉴定衬贴在离子赖以流动的离子孔上面的氨基酸顺序。1974—1999年间的种种探索表明，这条路是漫长而艰难的。几十年来已经知道，药理学物质如局部麻醉剂，能以间接、非竞争性方式阻断由烟碱型激动剂所引起的离子电流。局部麻醉剂可以成为一个有用的工具，用来对离子通道做化学标记。第一个实验用的是富含电鳗电板的受体膜。实验演示，在离体条件下，药理学活性浓度的局部麻醉剂并不从乙酰胆碱结合位点直接取代烟碱的配基，而是可逆地结合于另一个变构位点。局部麻醉剂之一的氯丙嗪还有额外的特征，它具有以共价键方式结合受体蛋白质的显著能力，通过简单的紫外线照射就可以显示。在富含受体的石纹电鳐（T. marmorata）膜制备上，氯丙嗪可以标记烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的4种α亚单位。而且精确定量测定的结果表明，它结合于每个单聚体2 α1β1γ1δ的高亲和力位点。在预期可以产生有功能性离子通道的条件下，如果氯丙嗪快速地与乙酰胆碱混匀，则它与此位点的动力学可以增加100倍。这意味着，氯丙嗪与功能性乙酰胆碱受体更容易结合。Changeux建议，氯丙嗪结合于离子通道的一个位点，此位点就在受体的假对称轴边上。当离子通道受激活而开放的时候，它就变得可以接受氯丙嗪的进入。就这样，通道可以在特异标记的条件下确定下来［8］。

再经过一年多的努力，才证明了氯丙嗪可以标记δ亚单位第二跨膜段（transmembrane segment 2，TM2）的丝氨酸。这个发现很快被其他研究组用同样的研究方法但不同的探针所证实。还有进一步的鉴定，在其他亚单位标记氯丙嗪的氨基酸位置，不仅显示有几个丝氨酸形成的环，还发现其他氨基酸是靠拢的，如亮氨酸和丝氨酸，这两个氨基酸位于离开丝氨酸环位置3～4个氨基酸处。由此得出结论：①TM2片段组成通道壁；②这些片段折叠成α螺旋；③氯丙嗪结合位点位于靠近赤道的位置，在通道的假对称轴上；④在乙酰胆碱和氯丙嗪结合位点之间，存在着正相互变构作用［8］。

与上述进展相平行，定向突变后的单通道实验记录也出来了。在爪蟾卵细胞重组受体分子γ亚单位的一个区域，此区域的位置在拟定的TM2片段及其附近TM2和TM3之间的弯曲部分。这一段被认为负责两种受体之间的差别，即电鳐的和牛的乙酰胆碱受体的电导差别。往后的分析鉴定了带负电的谷氨酰胺残基环。环被分成外环、中环和胞质环，这些环又漂亮地把氯丙嗪标记的氨基酸簇组成为框架，这样也就证实了它们在离子路径上的位置。其他研究组得到了类似的结论［8］。

进一步的研究鉴定了贡献给通道离子选择性的一些氨基酸。发现了3个残基，它们可以把通道的阳离子选择性转变为阴离子选择性。这样，一个兴奋性受体首次可以转变为一个抑制性受体。在其他受体如GABAA受体、甘氨酸受体、GluCl还有5-HT3受体中，相反方向的发现（即由阴离子通道转变为阳离子通道）也做出来了。然后又做出了功能性嵌合体，把α7乙酰胆碱受体的突触域与5-HT3受体的跨膜域嵌合起来。甚至原核细胞和真核细胞受体的域也可以结合起来并具有功能。这样就不容置疑地证明了受体超家族里面存在着保守的四级结构。最后，来自原核细胞的欧文氏菌属以及Gloebacter属配基门控离子通道（Erwinia ligand-gated ion channel，ELIC和Gloebacter ligand-gated ion channel，GLIC）的高分辨X射线衍射数据与nAChR离子通道的生物化学电子显微镜资料是相一致的。X射线衍射资料进一步证明，通道域在地域上不同于神经递质结合域，而神经递质与离子转运机制的相互作用是一种变构相互作用［8］。

图3-9　烟碱型乙酰胆碱受体最少4个状态的变构转变模型

CB：竞争性（正立体）阻断；ACh：乙酰胆碱；NCB：非竞争性（通道）阻断；AM：变构性调制；P：磷酸化位点。（图引自［8］）

此外在静息状态时，约有20%的受体存在于高亲和力脱敏状态中。在没有乙酰胆碱的条件下，肌细胞nAChR的自发通道开放也可以被记录下来。此现象排除了受体理论中所谓“诱导契合”（induced fit）的假设，而有利于构象选择模式。再有，情况似乎比调节性酶还要复杂些，存在着不止一个而是一系列开放和关闭构象之间的不同转变状态（图3-9）［8］。

直到近来还很少有信息可以帮助人们解释nAChR的结构转变，除了对电鳐受体的在体电子显微镜研究。在计算机模拟模型中，根据有关结构数据提供了关于受体蛋白质构象转变的新看法。正常的模式分析是用α7 nAChR的三维模型做的，通过这个模型的分析，把蛋白质运动分解为不同的模式。在第一批10个最低频率的模式中，第一个模式产生了结构重组，引起了孔的广泛开放，这是由于蛋白质四级扭转的对称的转变；同时伴有细胞外（上）及跨膜域（下）的相对方向扭转，以及每个亚单位相当程度的三级重新组构，特别是在蛋白质域的界面。四级扭转运动的金标准，可以合理解释已有的通道门控实验资料。原核细胞GLIC的X射线衍射结构研究，显示开放的通道构型；而ELIC的研究却显示关闭的通道构型。两者相比较，强有力的证据就出来了，发现至少有29%的四级扭转-转动模型可以解释通道的开放。研究的进一步发展，包括微秒水平的分子动力学研究［8］。

由nAChR所介导的信号转导过程，至少受3种变构调制物的调制。它们的结合位点明显不同于神经递质的结合位点或者离子通道。这些调制物被认为选择性地改变了变构的平衡，或者有利于主动的正性调制或负调制，后者即静息的去敏感化调制。这种构象的调制，并不需要竞争正空间排列的（orthosteric）受体结合位点［8］。

有一组调制物包括钙离子，能够增强多数神经元的乙酰胆碱受体，并结合于乙酰胆碱结合位点以下的细胞外域，其残基由两方面的亚单位界面提供。第二个重要的调制物集团包括加兰他敏（galantamine），结合于“非激动剂”界面。在异五聚体nAChR上，此界面不同于受体结合位点，而且似乎同源于丙二氮在GABA上面的结合位点［8］。

另一个变构调制位点相互作用于跨膜域。原来发现驱虫药伊维菌素（ivermectin）是α7 nAChR的强的正调制物，其作用因TM2突变而改变。全身麻醉剂不论是静脉麻醉的还是挥发麻醉的，都可以负性调制兴奋性nAChR，但正性增强抑制性GABA受体。用光亲和标记法研究GABAA受体，以及用X射线衍射方法研究GLIC与异丙酚（propofol）的复合体时发现，在每个亚单位的跨膜域上部有一个位点；在nAChR的这个位点上，烟碱型变构调制物可能也有相互作用。

在所有真核细胞的五聚体受体连接TM3和TM4的胞质环中，也鉴定出变构调制位点的存在，但在原核细胞中没有。nAChR有几个磷酸化位点，它调节肌肉里面的以及α7 nAChR的脱敏，也贡献给终板定位的、由聚集蛋白诱导的43K缔合蛋白（rapsyn）的酪氨酸磷酸化。α4 nAChR亚单位的细胞质域也结合于一系列脚手架蛋白，它们与脚手架蛋白及G蛋白系统相互作用，从而参与细胞内信号转导通路［8］。

分离了nAChR，并发现了GABA受体和甘氨酸受体的亚单位是nAChR的亲密直系同源蛋白质，这就确立了五聚体配基门控离子通道超家族的概念。整个神经递质的五聚体受体研究领域得到快速发展，包括在原核细胞里面发现了同源受体，其中有些是常用药物的靶，如箭毒、苯二氮以及全身麻醉药。近来对某些受体的X射线衍射研究取得了进展，为作用于脑的药物提供了合理的设计方案和研究途径。nAChR研究与很丰富的G蛋白偶联受体（GPCR）研究是相互平行发展的，但GPCR的鉴定比乙酰胆碱受体的鉴定实际上还要晚几年［8］。