花蕾发育成果实

植物雄性不育的发生是基因特异表达、生理生化反应以及形态建成的最终结果，许多研究表明植物不育与物质代谢、能量代谢及过氧化物保护酶活性有关，且关联情况不尽相同。有关桔梗雄性不育的生理生化研究尚未见报道，本研究对桔梗雄性不育花蕾发育过程中生理生化指标进行了动态分析，从物质代谢角度探讨桔梗雄性不育的发生机理，为桔梗雄性不育突变种质的有效利用提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

采用桔梗不育材料PA及其可育近等基因材料PB为试验材料，PA、PB为商洛桔梗同一栽培群体中选出的不育单株和可育单株材料，两者具有相近遗传背景。2007年3月20日育苗，5月25日移栽于香菊制药公司植物药园，栽培密度为10cm×25cm，田间管理同当地常规栽培。于盛花期晴天上午6:00～8:00按花蕾发育大小，共分11个等级(表2-10-1)取不同发育阶段的花蕾各10g，装入塑料自封袋后立刻装入冰盒，带回实验室后超低温保存备用。

表2-10-1　桔梗花蕾取材时期划分

续表

1.2　方法

可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法，可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法，游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法，超氧化物酶(Superoxide dismultase，SOD)活性测定采用氮蓝四唑(TNB)光化还原法，过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性采用紫外吸收法，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法。实验设置3次重复，利用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　桔梗雄性不育花蕾发育过程中可溶性糖含量变化

不育材料和近等基因可育材料花蕾发育过程中可溶性糖含量变化见图2-10-1，可以看出:

(1)不育花蕾和可育花蕾在发育过程中可溶性糖含量变化趋势相同，均呈“单峰”曲线变化，即随着幼蕾逐渐发育可溶性糖含量逐渐升高，到开花当天花蕾可溶性糖含量达到最高，之后开始下降。

(2)花前花蕾发育的各阶段可育花蕾可溶性糖含量均高于相应不育花蕾，而开花当天和花后1d不育花可溶性糖含量高于可育花。

(3)花蕾发育过程中，可育花蕾和不育花蕾可溶性糖含量变化趋势虽然相同，但变化幅度明显不同;可育花蕾从幼蕾到开花发育过程中可溶性糖含量逐渐平缓升高，而不育花蕾可溶性糖含量升高速度较快，特别是开花前2d到花蕾开放这一时期，不育花蕾可溶性糖含量升高了73.56%，而可育花蕾仅升高了10.18%。

图2-10-1　桔梗不育花蕾和可育花蕾可溶性糖含量的动态变化

2.2　游离脯氨酸含量

花蕾游离脯氨酸含量变化见图2-10-2，从图可以看出:

(1)花蕾发育的各时期，可育花蕾游离脯氨酸含量均高于相应不育花蕾，二者比值最高为花前2d花蕾，此时可育花蕾游离脯氨酸含量为不育花蕾的7.33倍。

图2-10-2　桔梗不育花蕾和可育花蕾游离脯氨酸含量的动态变化

(2)随着花蕾的发育，可育花蕾不断积累游离脯氨酸，其含量呈上升趋势，到花前2d达到最高，为63.58μg/ml，开花后其含量迅速下降到较低的水平;而不育花蕾在发育过程中几乎不积累游离脯氨酸，其含量一直处在较低水平，也没有明显规律变化。

2.3　可溶性蛋白质含量

桔梗花蕾发育期可溶性蛋白质含量变化见图2-10-3。由图可知:①随着花蕾的发育(从幼蕾1到开花当天)，可育花蕾可溶性蛋白质含量逐渐降低，花蕾开花当天其含量达到最低;而不育花在花蕾发育前期(从幼蕾1到大蕾2)可溶性蛋白质含量基本保持稳定，大蕾2之后，其含量明显降低;开花后桔梗不育花和可育花可溶性蛋白质含量明显升高，之后随着花后时间的延长，其含量又明显下降。②随着花蕾的发育(从幼蕾1至开花当天)，可育花蕾可溶性蛋白质含量均高于相应不育花蕾，且在幼蕾期和中蕾期二者可溶性蛋白质的比值维持在1.70～1.86范围。

图2-10-3　桔梗不育花蕾和可育花蕾可溶性蛋白质含量的动态变化

2.4　抗氧化酶活性变化

桔梗各发育期花蕾抗氧化酶活性变化情况见图2-10-4，从图中可以看出:①花蕾发育各时期(从幼蕾1至花前2d)，不育花蕾SOD活性略高于可育花蕾，POD、CAT活性则明显高于相应可育花蕾;开花后各发育时期，不育花CAT活性仍高于可育花，而SOD活性则低于可育花。②随着花蕾的发育，不育花蕾与可育花蕾SOD变化趋势基本相同，即在花蕾发育初期均呈缓慢上升趋势，至开花前活性上升速度加快，开花当日SOD活性达到最大，花后1d活性明显降低，而后又升高。幼蕾期1至花后1d不同发育阶段，不育花蕾和可育花蕾POD活性变化较为平缓，但不育花蕾POD活性始终维持在较高水平，而可育花蕾酶活性水平较低;发育后期(花后2d)可育花POD活性开始明显下降，而不育花酶活性明显升高。在发育的各时期不育花和可育花CAT活性有相同的变化趋势，即发育前期酶活性均逐渐上升，达到最大活性后开始下降;但与可育花蕾相比，不育花蕾CAT活性升高幅度大于可育花蕾。

图2-10-4　桔梗不育花蕾和可育花蕾SOD、POD、CAT、MDA活性的动态变化

2.5　丙二醛含量变化

花蕾发育过程中丙二醛含量变化情况见图2-10-4。在花蕾发育的各阶段，不育花蕾和可育花蕾丙二醛含量的变化趋势基本相同，总体上表现为先升后降的变化趋势;但在花蕾发育前期(大蕾期2之前)，不育花蕾丙二醛含量逐渐升高，而可育花丙二醛含量变化较为平缓，并维持在较低水平上;大蕾期2之后不育花丙二醛积累更为迅速，到开花1d后其含量达到最高，为5.0μmol·g-1，比相应可育花丙二醛含量高2.85倍。

从图2-10-4还可以看出，在花蕾发育各个阶段，不育花丙二醛含量均高于相应可育花，特别是在开花后，这种差异变得更为明显。

表2-10-2　桔梗不育花蕾和可育花蕾SOD、POD、CAT、MDA活性的动态变化

3　讨论

伴随植物呼吸作用的进行，其体内也不断地产生对植物细胞有危害作用的活性氧等自由基。在正常情况下，植物体内活性氧等自由基的产生和清除处于动态平衡状态，但在生境胁迫、代谢紊乱、花药败育等特殊情况下，常常诱导体内活性氧等自由基的增加，导致机体受到各种伤害。植物体内负责清除氧自由基的酶系主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等，关于SOD、POD、CAT等保护酶与雄性不育的关系，目前存在两种不同的认识:对水稻、小麦、玉米、油菜等不育系花蕾发育的研究结果认为，不育系中保护酶活性下降，致使活性氧水平升高，膜脂过氧化作用增强而使细胞受损，引起小孢子生长发育出现异常从而导致雄性不育的发生;另外一些研究结果表明，不育系花蕾中保护酶活性水平高于其保持系，认为这是不育系对其体内活性氧水平升高的应答反应。本研究结果与后者的观点较为吻合，桔梗花器官发育过程中，不育花蕾SOD、POD、CAT活性均高于相应可育花蕾。SOD是一种典型的诱导酶，其活性水平的升高反映了植物细胞活性氧含量的增加，SOD酶促反应产物H2 O2又可诱导POD和CAT活性升高。桔梗不育花蕾发育过程中SOD、POD、CAT保护酶活性的升高，很可能是由于不育花蕾氧自由基代谢发生紊乱导致细胞活性氧积累，这些活性氧作为诱导因子促使保护酶活性水平提高。

一般认为丙二醛在植物体内积累是活性氧毒害的表现，它的含量是判断膜脂过氧化程度的一个重要指标，许多研究表明，小孢子败育伴随有膜脂过氧化作用，膜脂过氧化作用的增强是不育系的一个普遍特征。陈贤丰等、张明永等、赵前程等、段俊等、周仲华等分别在研究水稻、玉米、油菜及棉花等不育花药时发现，较高的自由基和MDA含量是导致雄性不育的重要原因之一。本研究结果显示，随着桔梗雄性败育材料花器官的发育，不育花蕾丙二醛不断积累，其含量和增加速度均明显高于相应可育花蕾，这表明在桔梗不育花蕾生长发育过程中，其膜脂由于过氧化作用而受到的损伤要明显高于可育花蕾。

对桔梗不育材料活性氧代谢的研究结果显示，不育花蕾活性氧清除酶活性升高，但丙二醛的积累也明显增加，这表明不育花蕾活性氧的产生速度要明显高于清除速度，活性氧清除酶活性水平的提高只能部分清除细胞内产生的氧自由基，而积累在细胞中的活性氧自由基使膜脂过氧化造成细胞损伤，引起小孢子发育异常而导致桔梗雄性不育。因此，花蕾发育过程中氧自由基代谢紊乱和膜脂较强的过氧化作用可能是导致桔梗雄性不育的原因之一。

游离脯氨酸、可溶性糖和蛋白质在植物体内具有广泛的生理作用，不仅可为植物的生命活动提供能量和为其他物质的合成提供中间产物，又是细胞的重要组成部分，同时对小孢子的发育极为重要。许多研究表明，植物器官的物质和能量代谢水平异常与雄性不育的产生有关，不育花蕾中游离脯氨酸含量降低是较为普遍的现象。本研究与前人取得的结果基本一致，桔梗花蕾发育的各阶段，可育花蕾游离脯氨酸、可溶性蛋白质和可溶性糖含量均高于不育花蕾，其中尤以游离脯氨酸表现最为明显，花蕾发育过程中，可育花蕾游离脯氨酸不断积累，而不育花蕾含量一直处在较低水平。

桔梗不育材料花器官发育过程中，花蕾活性氧等自由基产生和清除的动态平衡状态被破坏，使细胞内活性氧等自由基含量升高，在氧自由基的诱导下，不育花蕾SOD、POD、CAT等保护酶活性水平明显提高，使细胞对活性氧等自由基的清除能力也有所增加，但由于细胞过快的自由基产生速度，仍然造成氧自由基在不育花蕾中的积累。细胞内对自由基最敏感的部位是细胞膜，自由基使细胞膜的不饱和脂肪酸发生过氧化或脱脂化，被逐级降解为丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，造成桔梗不育花蕾中MDA含量升高。MDA具有强交联性质，花蕾中MDA含量的增加使细胞内多种分子发生聚合及交联，引起许多蛋白结构变化和功能的丧失，细胞内这些变化可能影响不育花蕾可溶性糖、可溶性蛋白质、游离脯氨酸等物质的合成，造成不育花蕾物质合成的紊乱，使小孢子生长发育出现异常，最终导致桔梗雄性败育。

4　结论

在桔梗花器官发育过程中，取不同发育时期的桔梗花蕾，测定其可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢活性和丙二醛含量，比较分析桔梗不育材料与可育材料花蕾发育过程中生理生化特性差异。结果表明:①花前花蕾发育的各阶段，桔梗不育花蕾可溶性糖含量、游离脯氨酸含量和可溶性蛋白质含量均低于相应可育花蕾，其中尤以游离脯氨酸表现最为明显，随开花前花蕾的发育，可育花游离脯氨酸含量不断升高，而不育花蕾中其含量较低且变化很小;②与可育花蕾相比，不育花蕾在发育过程中SOD、POD、CAT活性变化趋势基本相同，但其活性明显高于可育花蕾;③在桔梗花蕾发育的各阶段，不育花丙二醛含量均明显高于相应可育花。桔梗不育花蕾(开花前)生长发育过程中，体内活性氧代谢失调、丙二醛积累及游离脯氨酸等“物质代谢损亏”可能是引起桔梗雄性败育的原因。