桔梗雄配子体发育异常

桔梗雄配子体发育异常_花粉母细胞减数分裂及雄性败育的细胞生理学机理_桔梗生殖生物学及

目前桔梗生产主要以人工栽培为主，然而因其遗传育种研究基础较为薄弱，生产中长期缺乏优良栽培品种，引起桔梗品质劣变、产量下降、加工成本增加等严重后果。桔梗雄性不育新突变体的发现及优良不育系培育为桔梗杂交品种筛选提供了育种思路。因此，对桔梗不育系和保持系花粉母细胞减数分裂、雄配子体发育以及花药发育过程中其生理生化特性的动态比较研究，在阐明桔梗雄性不育发生的细胞生理学基础和桔梗杂种优势利用等方面具有重要意义。

关于桔梗不育材料花药发育的研究已有相关报道，但因不同学者使用研究材料败育类型不同，所获得结果并不完全一致。魏建和等首次获得了桔梗雄性不育材料，吴基日等、王志芳等、刘自刚等相继在不同栽培群体中发现鉴定了桔梗雄性不育突变材料，这些发现拓宽了桔梗雄性不育源的遗传基础。刘自刚还对不育材料传粉生物学、结实特性［5］、育性在不同生境中的稳定性进行了比较研究。魏建和等研究了不育材料JA，发现JA162败育发生在造孢细胞至花粉母细胞期，败育花药中形成的花粉母细胞数量仅有正常数目的一半，且其在减数分裂前因液泡化而解体;而JA37败育发生在四分体期，由于减数分裂形成的异常四分体不分离，最终解体而导致败育。吴松权等以不育种质JXB-1无性繁殖后代为材料，研究认为花粉母细胞减数分裂形成四分体，小孢子可以被释放并相互分离，但绒毡层细胞在减数分裂后期提前解体，导致了小孢子发育的异常而败育。前人采用不同遗传背景的桔梗不育材料，对雄性不育花药发育进行了比较研究，但均未涉及不育系和保持系花粉母细胞减数分裂和染色体行为的比较以及花药发育过程中生理生化动态研究，而花粉母细胞减数分裂是花粉发育过程中的重要环节，生理生化特性异常与雄性败育发生密切关联，且关联情况不尽相同;探究花药发育的生理生化特性和花粉母细胞减数分裂期间染色体行为及之后小孢子发育特征是研究雄性败育发生的重要方法，因此对桔梗不育系及其保持系花粉母细胞减数分裂和雄配子体发育的比较以及花药发育的生理生化动态研究具有重要意义。

以桔梗新不育系PA和保持系PB为实验材料，对桔梗花粉母细胞及小孢子发育过程进行了比较观察，对花药发育过程中其生理生化动态进行研究，旨在揭示桔梗雄性不育材料PA败育的生理生化和细胞学机理，为进一步探究其败育的分子遗传机制、不育系材料的选育及桔梗杂种优势利用供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

采用桔梗不育系PA及其保持系PB为试验材料，2007年7月于陕西商洛桔梗栽培群体中发现了雄性不育突变材料，对其进行了鉴定并编号为PA;选同一群体优良可育单株进行连续自交，同时用PB连续给PA回交授粉5代，获得遗传稳定的不育株系PA及其保持系PB材料。不育系PA雄蕊短小、花药干瘪萎缩，灰褐色，花药中有极少量外形不规则败育花粉，而其雌蕊、蜜腺均发育正常，花冠略大，异花人工授粉和天然授粉结籽率与保持系PB相同;保持系PB成熟花药饱满，淡黄色，开裂后散出大量花粉沾满柱头。遗传分析表明桔梗不育系PA属质-核互作不育型。2010年3月20日育苗，5月25日移栽，栽培密度为10cm×25cm，田间管理同当地常规栽培。

1.2　方法

1.2.1　花粉母细胞减数分裂

于盛花期晴天上午采集不同大小的花蕾，用压片法经改良苯酚品红染色，在光镜下确定花药各发育时期与花蕾形态间的相关关系，然后取不同发育时期的花药剥去花被，卡诺液固定12～24 h后，经95%、80%乙醇后转入70%乙醇中4℃保存备用。改良苯酚品红染色压片，中性树脂封片，显微镜观察并拍照。

1.2.2　雄配子体发育

取材、固定、保存同“1.2.1”的方法。取下花药后经50%、25%乙醇过渡到蒸馏水，停留2 h后，稀释的爱氏苏木精染色24 h，蒸馏水换洗4～5次，改用自来水换洗4～5次，以20%浓度梯度的乙醇逐级脱水后用无水乙醇与冬青油1：1混合液过渡，最后用冬青油透明2次，压片镜检并照相。

1.2.3　花药发育

取材、固定、保存同“1.2.1”的方法。常规石蜡切片，切片厚度8～10μm，铁矾-苏木精染色，显微镜观察并拍照。

1.2.3　生化指标测定

可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法;游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法，超氧化物酶(superoxide dismultase，SOD)活性测定采用氮蓝四唑(TNB)光化还原法，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法［12］。实验设3次重复，利用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

表2-12-1　桔梗花蕾取材时期划分

续表

2　结果与分析

2.1　桔梗不育系PA花粉母细胞减数分裂及其雄配子体发育

桔梗雄性不育系PA花粉母细胞减数分裂前期Ⅰ(图2-12-1，1)、中期Ⅰ(图2-12-1，2)细胞形态及染色体行为与保持系PB材料基本一致;减数分裂后期Ⅰ不育系PA同源染色体均等分离并向两极移动，但此时细胞质形态已出现明显异常(图2-12-1，3);后期Ⅱ时在一些母细胞中观察到两个子核染色体分离不同步现象，同时胞质形态异常(图2-12-1，4)。桔梗不育系PA减数分裂末期Ⅱ姊妹染色单体分向两极，并去凝缩形成染色较深的区域(图2-12-1，5)，但末期Ⅱ结束后细胞质不能正常分离形成四分体(图2-12-1，6)，之后一些子核在细胞内溶解，只残留胼胝质空壳(图2-12-1，7);有一些细胞能形成胼胝质包裹的四分体，但胼胝质壁在后期发育中一直难以被降解而是放出游离的小孢子(图2-12-1，8～9);仅少量四分体是放出形态异常的小孢子(图2-12-1，10);之后异常四分体、变形小孢子等在细胞内开始溶解(图2-12-1，11)，此后药室内只残存大量细胞碎片(图2-12-1，12)。

图2-12-1　桔梗不育材料PA减数分裂及配子体发育

1.前期Ⅰ;2.中期Ⅰ(侧面观)，示染色体排列在赤道板面;3.后期Ⅰ，示同源染色体可正常分离但细胞质出现异形;4.后期Ⅱ(纺锤体垂直)，细胞形状异常;5，6.四分体期，示细胞质不能正常分裂;7.四分体期，示部分四分体降解后残留的胼胝质壁空壳;8.小孢子不能从四分体中释放出来;9.不能分离的4个小孢子;10.异形小孢子;11.异形小孢子大量解体;12.小孢子解体后的碎片

2.2　桔梗不育系PA和保持系PB花药结构比较

桔梗保持系PB花药横切面结构呈蝶形，花药壁结构完整，有表皮层、药室内壁、中层和绒毡层，各层细胞均排列整齐，造孢细胞呈半同心圆排列(图2-12-2，1)，在花粉成熟期可观察到在药室中存在大量正常花粉(图2-12-2，3);不育系PA花药横切面也称蝶形，但花药结构明显与保持系花药不同(图2-12-2，2)，花药绒毡层细胞排列不整齐，边缘不清晰，花药成熟期只有空的药室其内没有花粉粒(图2-12-2，4)。

图2-12-2　桔梗可育花药与不育花药结构比较

1.可育花药4个药室和排列整齐的新月状造孢细胞;2.不育花药异常的药室结构;3.可育药室中的大量花粉粒;4.不育花药的空药室

3　讨论

3.1　桔梗的遗传重组

从桔梗减数分裂前期、中期二价体形态来看，同源染色体配对后在染色单体间发生过多次交换，在形态上形成多个交叉点。这表明桔梗在减数分裂过程中通过遗传重组形成包含丰富遗传变异的镶嵌染色体，丰富的可遗传变异为自然选择和适应性提供了潜质和素材，也是一个物种成功适应多变生境的遗传基础。

减数分裂过程中同源染色体间发生片断交换可打破基因间连锁关系，一个连锁群的两个基因间发生重组的频率越高，基因的连锁关系越容易被解除，特别是当交换发生在有利基因和不利基因间时，通过同源染色体间片断重组即可高效地将优良基因富集在同一个体中，通过植物育种途径培育出优良桔梗新品种。

3.2　桔梗减数分裂细胞质分裂方式

植物减数分裂中胞质分离主要有两种方式:一种是双子叶植物普遍采用的同时型，即减数分裂细胞核分裂结束后细胞质进行分裂，形成四分体;另一种是多数单子叶植物采用的连续型，即第一次减数分裂后细胞质进行一次分裂形成二分体，第二次减数分裂结束后细胞质又进行一次分裂形成四分体。四分体形态主要取决于第二次减数分裂中期两个纺锤体的空间取向，纺锤体相互垂直则形成的四分体为四面体构型，相互平行则为四角形四面体。桔梗为双子叶药用植物，其细胞质分裂为同时型，第二次减数分裂结束后细胞质分裂形成四分体，四分体形态主要以四面体为主，也可观察到四角形染色体。

3.3　桔梗绒毡层细胞

绒毡层是由花药壁最内1～2层细胞构成的具有分泌功能的哺育组织，可向药室内分泌释放各种营养物质和大量酶类成分，为花粉母细胞和小孢子各阶段的发育提供了所必需的物质基础。绒毡层细胞的正常发育与花粉育性的最终形成二者间存在极为密切的关联，绒毡层细胞在形态、结构及功能等方面的异常均可能引起植物雄配子体发育进程受阻，引起成熟花粉育性降低甚至导致彻底败育，大量研究均表明植物雄性不育的发生几乎均与绒毡层发育异常有关。本研究中也观察到在花粉形成期间桔梗保持系PB和不育系PA二者绒毡层细胞发育进程存在明显差异，保持系PB材料绒毡层细胞正常发育，在减数分裂期间细胞双核化，双核细胞一直保持到小孢子单核靠边期末至双核花粉期才被降解。而不育系PA材料绒毡层细胞始终保持单核状态并在四分体时期即被降解，由于绒毡层细胞提前降解而使药室无法积累足够的水解酶类物质以溶解胼胝质壁，使四分体不能释放游离小孢子而最终导致败育发生。

3.4　桔梗雄性不育系PA败育发生时期和特点

与保持系PB相比，桔梗不育系PA的减数分裂中期Ⅰ以前花粉母细胞形态和染色体行为未见异常，而后期Ⅰ之后，花粉母细胞细胞质明显出现异常形态，第二次减数分裂结束后花粉母细胞不能正常进行胞质分裂，形成异形四分体。对桔梗不育系PA败育的遗传学基础的研究结果表明，不育系PA雄性败育发生受细胞质和细胞核基因共同控制，属质-核互作不育型。对植物核-质互作不育材料的遗传分析表明，控制植物雄性不育的胞质基因一般位于线粒体DNA上。桔梗不育系PA减数分裂细胞质形态和分裂行为的异常，可能与其胞质基因的突变有关。细胞质是高度有序的组织结构，这种组织结构有序性无疑在维持细胞质形态和保证分裂期胞质正常分割等方面发挥重要作用，桔梗线粒体基因可能参与了胞质这种有序结构的组织构建，桔梗雄性不育系PA花粉母细胞线粒体育性基因的突变引起胞质结构功能等方面的改变，造成花粉母细胞在减数分裂期胞质形态变异和胞质分裂障碍，最终形成异常四分体。

3.5　桔梗雄性不育系PA与保持系PB生理生化特性差异

一般认为丙二醛在植物体内积累是活性氧毒害的表现，它的含量是判断膜脂过氧化程度的一个重要指标，随着桔梗花蕾发育，不育花蕾丙二醛不断积累，其含量和增加速度均明显高于相应可育花蕾，说明在桔梗不育花蕾生长发育过程中，可能因膜脂过氧化作用而受到的损伤要明显高于可育花蕾。对桔梗不育材料活性氧代谢的研究结果显示，不育花蕾活性氧清除酶活性升高，但丙二醛的积累也明显增加，这表明不育花蕾活性氧的产生速度要明显高于清除速度，活性氧清除酶活性水平的提高只能部分清除细胞内产生的氧自由基，而积累在细胞中的活性氧自由基使膜脂过氧化造成细胞损伤，引起花蕾发育异常而导致桔梗雄性不育。因此，花蕾发育过程中活性氧代谢紊乱和膜脂较强的过氧化作用可能是导致桔梗雄性不育的原因之一。

许多研究表明，植物器官的物质和能量代谢水平异常与雄性不育的产生有关，不育花蕾中游离脯氨酸含量降低是较为普遍的现象。本研究与前人取得的结果基本一致，桔梗花蕾发育的各阶段，可育花蕾游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量均高于不育花蕾，其中尤以游离脯氨酸表现最为明显，花蕾发育过程中，可育花蕾游离脯氨酸不断积累，而不育花蕾含量一直处在较低水平，游离脯氨酸和可溶性蛋白质代谢损亏可能是导致桔梗败育的原因之一。

4　结论

(1)桔梗不育系花蕾活性氧代谢紊乱、丙二醛积累及游离脯氨酸等“物质代谢损亏”可能是引起败育的生理生化原因。

(2)桔梗不育系PA花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育异常，其败育过程大体可分为4个阶段，第一阶段在减数分裂中期Ⅰ细胞质形态出现异常;第二阶段在减数分裂末期Ⅱ后细胞质不能正常分裂，形成异常四分体;第三阶段四分体胼胝质壁不能溶解，难以释放出游离小孢子;第四阶段异常四分体、粘着小孢子和异形小孢子被降解，药室中只残留降解碎片，使花药干瘪造成败育。

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