培养方式的选择

一般而言，培养方式可分为“现场培养（In Situ Incubation，IS）”和“模拟现场培养（Simulated In Situ Incubation，SIS）”两种方式。下面分别就两种方式的优缺点进行论述。

一、现场培养法

如图2－1所示，从调查船或悬浮装置上放下一根绳子，将培养瓶按采样深度固定在绳子的不同位置，最下端缀上重物，一同放入海水中。由于培养瓶与垂直主绳之间有一定的活动余地，因此海水不断带动培养瓶一起晃动，使得培养瓶内的海水可以避免呈静止状态；此外，培养瓶处于原设定深度，温度和光照条件与原水环境更加接近，因此现场培养法是比较理想的培养方法，所得结果也较为准确。但缺点是需要船舶抛锚直到培养结束，因此在实际操作中易受到天气、海况和人力物力资源的限制。

图2－1　初级生产力原位现场培养（船舶抛锚）

二、模拟现场培养法

模拟现场培养法是指将海水样品从原设定的深度取出后，在船上模拟海水中的环境（温度、光照、波浪晃动等），从而进行模拟培养。相对于原位培养，模拟培养的优点是比较灵活，能够节省考察船的时间。但由于温度、光照和海洋动力环境难以完美模拟，所以其缺点是可能与实际生产力有一定的误差。尤其对深水层进行模拟时，在岸上提供相似的温度、光照和动力条件往往具有一定的难度，使得模拟培养与原位培养总会有一定的不可控制误差。

图2－2（a）所示为静置模拟培养法，只需要将培养瓶放置在甲板上，用流动的海水控制温度。其缺点是：缺乏摇动，温度和阳光与原环境有一定差距，导致与原位培养结果可能有较大误差。

图2－2（b）为改进后的旋转培养法，增加了晃动。彭兴跃等（1997）的实验表明，培养过程中的搅动非常重要，该图的设计所得结果比静置培养方式更好。

在辽河三角洲的实际调查中，如条件允许，我们一般将培养瓶注射NaH14CO3示踪剂后密封，并置于原水层中随海水波动而晃动，这样的培养方式在一定程度上更贴近周围水体的实际温度、光照和水动力环境。当海况较差时，受限于现场条件，我们偶尔也使用模拟现场培养法，其培养方式介于上述两种方式之间，一般用人为的周期性晃动来模拟现场动力条件，用流动海水从培养瓶外侧模拟原水层温度。

图2－2　静置培养法（a）与旋转培养法（b）

三、取样和培养

在辽河三角洲开展的调查中，用南森采水器对表层水和底层水进行现场采样（图2－3），并对各项水文参数进行实时测定和分析，包含温度、盐度、pH值等。盐度通过盐度计测定，透明度和透光层深度（Z）使用Secchi disk测定，溶解氧（DO）使用YSI多参数水质分析仪（美国，型号NC41－Pro　20）现场测定。

图2－3　现场采取水样并进行初步过滤

采取水样时，避免污染是开展后续实验的关键。且不可用真空泵抽取各层水样，这在很多国际操作规程中是被禁止的。透明合成树脂采水器或Van Dorn采水器等都是比较理想的选择。

为减少后续培养过程中浮游动物对浮游植物的捕食作用，在将水样加入培养瓶前，最好能用尼龙筛网过滤，筛网孔径根据浮游动物密度和大小来决定，一般0．3mm孔径可以过滤掉大部分的浮游动物。根据实际情况，筛网孔径可减至更小，在本调查中，我们使用37μm孔径筛网对水样进行过滤，以减少浮游动物的影响。在准备培养实验的同时，使用GF/F滤膜过滤部分水样，取滤膜冷冻保存，以测定叶绿素含量。该叶绿素含量可结合后期14　C培养结果来计算碳同化系数。

如图2－4所示，将经筛网过滤后的水样注入3个容积为300mL的透明BOD培养瓶和3个外壁漆黑的BOD培养瓶，每瓶加入1～5μL CiNaH14CO3示踪剂后，密封。将6个培养瓶平行置于预定的水层中或模拟水层的流动水体培养器具中，并记录培养时间。

图2－4　开展14　C培养实验室取样、标记和培养过程

关于培养时间的长短，一直是学术界比较有争议的话题。Marra等（2007）曾推荐24h昼夜培养，因为这样经历了白天光合作用和夜晚呼吸作用的过程，似乎更符合生态系统规律。然而在很多实际培养中，并非一个完整的昼夜，如Karl等（1998）针对Hawaii Ocean Time－Series（HOT）站点ALOHA开展的培养便是从早晨太阳升起至晚上太阳落下（约12h），而早期则出现过从0．5～24h不同时间段的培养。根据以往研究经验，培养时间可以灵活选取，一般在生产力较高的沿海水域，培养时间可以为2～6h之间，不超过10h，考虑到氧浓度的变化和细菌生长，一般采用4h；而在生产力较低的外海水域或湖泊中，则可以适当增加培养时间。一般情况下，若条件允许，适当延长培养时间有利于提高最后计算结果的精度，因为在光照条件下随着培养时间的增加，碳吸收量也会增加。

关于培养瓶的体积，Gieskes等（1997）曾指出培养瓶的大小对14C方法测定结果有影响，然而Laws等（2000）的现场测定则表明，不同大小的培养瓶结果相近，并不存在所谓的“bottle－size effects”。根据以往的培养经验，瓶子体积在250～500mL之间既能满足基本的培养后取样要求，也比较方便操作。

培养结束后，为测定每个培养瓶中溶液的总14　C放射性活度（ATC），从每瓶中取3个5mL平行水样分别置于闪烁瓶中，加入0．5mL　1NNaOH（或苯乙胺）用于固定溶解态14　C；类似地，为测定总有机碳（TOC）的放射性活度（ATOC），另取3个5mL平行水样分别置于闪烁瓶中，加入0．5mL　1NHCl，移入通风橱中放置24h以排出无机碳，如图2－5所示。

随后，立即从每个培养瓶中抽取50mL水样，过滤，取滤膜置于闪烁瓶中，用于测定颗粒有机碳（POC）的放射性活度（APOC）；并移取5mL滤液置于闪烁瓶中，用于测定溶解有机碳（DOC）的放射性活度（ADOC）。如此重复取样3次。同时，在放置滤膜和滤液的闪烁瓶中均加入0．5mL　1NHCl，置于通风橱中24h以排出无机碳。如过滤后，滤膜不能立即进行酸化处理，则需要将滤膜置于－20℃冷冻，直至能进行酸化和通风处理。

在所有闪烁瓶中加10～15mL闪烁液（Ultima Gold LLT），并用超低本底液体闪烁谱仪（QUANTULUS　1220，PerkinElmer Inc．）（或液体闪烁计数仪）测定14　C放射性活度。为消除海水中14　C本底的影响，利用以上类似步骤分别过滤海水水样，以相同步骤取GF/F滤膜和滤液，测定14　C放射性活度，并做空白校正。研究表明，将用闪烁液固定的闪烁瓶放置30d后，再测定放射性强度能够得到一个更好的结果，但须注意应避光保存。

图2－5　原位培养试验后对14　C样品的处理和测试