种曲就是种子。制种曲就是对曲菌进行纯培养，使之产生大量孢子，用以接种来制成成曲。制种曲的关键是要保证曲菌的纯正和具有良好的性能，所以对种曲制造的过程要求十分严格。
（一）菌种的选择
曲菌的生理与生化作用是决定酱油性质的重要因素，而且会影响酱油的色、香、味以及原料利用率等。目前酱油酿造中所用的曲菌是米曲霉，但是有很多变种。酿造酱油的曲霉菌种应符合下列条件：（1）不产生黄曲霉毒素；（2）蛋白酶及糖化酶活力强；（3）生长繁殖快，对杂菌抵抗力强；（4）发酵后具有酱油固有的香气而不产生异味。
1957年将选出的酿造酱油的优良菌株，定名为中科3.863号米曲霉。后来上海市酿造科学研究所又将中科3.863号米曲霉进行诱变育种，获得性能更好的新菌种沪酿3.042号米曲霉，经中国科学院微生物研究所审核，编号为中科3.951号米曲霉。它与原菌株比较，有以下几方面优点：（1）蛋白酶活力比原菌株显著提高。（2）分生孢子形状大，数量多，生长繁殖速度比原菌株更快，制曲时间大大缩短。（3）对杂菌抵抗力强，容易制曲。（4）发酵后的酱油香气好，现在普遍使用的是此菌种。
（二）试管菌种的培养及保藏
1.培养沪酿3.042号米曲霉，采用专用培养基。培养基的成分为：
豆汁 1000毫升
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.5克
可溶性淀粉 20克
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1克
硫酸铵[（NH4）2SO4] 0.5克
琼脂 20克
pH值 6.0
（1）豆汁制备：豆粕或豆饼加5倍水煮沸（用小火煮）l小时，边煮边搅拌，然后过滤。每100克豆粕或豆饼可制成5°Be′豆汁（多则浓缩，少则补水）。
（2）灭菌：采用100千帕加压灭菌30分钟，灭菌完毕，缓慢降压，灭菌后趁热将试管摆成斜面，冷却检验无菌后备用。
2.将原菌种接入试管斜面培养基上，每月接种一次，然后置于30℃恒温箱内培养3天，待长满孢子呈黄绿色后取出。
3.菌种可保藏在冰箱内，保持在4℃左右，接种时间可延长至3个月转接一次。
（三）三角瓶扩大培养
三角瓶固体曲扩大培养基的配方为：①麸皮80克，面粉20克，水80毫升；②麸皮85克，豆饼15克，水90毫升；③麸皮100克，水95毫升。
1.灭菌
将上述配料混匀后分装于经干热灭菌的250毫升三角瓶中，每瓶约装湿料10克（使其厚度在1厘米左右），采用100千帕灭菌30分钟，冷却后备用。
2.接种及培养
在无菌条件下接入试管斜面菌种。摇匀后置于30℃恒温箱内培养18小时左右，三角瓶内曲料已稍发白结饼，摇瓶一次，将结块摇碎。继续置于30℃恒温箱内培养，再过4小时左右，又发白结饼，再摇瓶一次。经过2天培养后，把三角瓶轻轻地倒置过来，继续培养一天，全部长满黄绿色孢子后即可使用。若需放置较长时间，则应置于阴凉处，或置于冰箱中备用。
（四）种曲的制作
1.种曲室
种曲室的容积，以小型为宜，一般长4米，宽3.5米，高约3米。墙壁厚度因地区寒暖情况而定，应考虑不受外界气温的影响。种曲室具有门、窗和天窗各一，平顶弧形，水泥地，四壁及平顶涂水泥，置有排水沟及保暖设备，能全部密封，便于灭菌。制造种曲最忌杂菌感染，因而种曲室的位置应选择环境清洁的场所。
2.制作工具
制作酱油的工具有：竹匾或曲盘，竹匾的直径一般为90厘米左右。曲盘一般长45厘米，宽45厘米，高5厘米，底板刨光，背面横钉l厘米厚的木条3根；纱布或稻草帘用于调节湿度；木制台或水泥池用作拌和台；八目/2.54厘米的筛子、竹箩和木铲等。
3.灭菌工作
要保住种曲的质量，达到米曲霉分生孢子多，纯粹度高，除在原料处理、操作方面要注意外，制种曲前要对种曲室和用具严格消毒，工作人员也应加强无菌操作，以避免种曲被杂菌污染。
（1）曲室及竹匾或曲盘灭菌：种曲室每次使用前要彻底洗净。竹匾或曲盘每次用后需用水彻底洗净晒干，放人种曲室内，同时将其他应灭菌的物品（包括竹箩、用具等）也全部移人种曲室内准备灭菌。灭菌前须密封门窗、缝隙和洞孔。灭菌药剂用甲醛或硫磺。甲醛对细菌及酵母的灭菌力较强，但霉菌对甲醛的抵抗力很强，要达到彻底灭菌是比较困难的。利用硫磺灭菌较为普遍。如果甲醛及硫磺两种混合使用，则效果更好。灭菌的方法采用熏蒸法，即将药剂放在小铁锅内，置于火炉上，使其缓缓燃烧或蒸发，弥漫于曲室内，密闭20小时以上，达到灭菌的目的。单独使用甲醛熏蒸时，也可不用火炉，而将工业用高锰酸钾直接加入甲醛中，使甲醛气体挥发出来，但必须防止溅泼。高锰酸钾的加入量约为甲醛的一半。药剂用量为每立方米用硫磺25克或甲醛10毫升。使用炉火应加防护装置，以保证安全。
（2）纱布或草帘灭菌：纱布或草帘用水浸泡后，采用蒸汽灭菌（100℃，保持1小时），然后沥干。移入种曲室时要用灭菌后的盛器盛装，面层用灭过菌的布覆盖，迅速移入种曲室。
（3）操作人员手的灭菌：拌纯种、装匾或装盘及翻曲等，凡用手直接接触种曲生产工具或曲料时，必须用肥皂在种曲室外将手洗刷干净，再用体积分数为75%的酒精擦手。操作时，若手接触过皮肤、衣服或不洁处，应再擦酒精灭菌。
4.制作方法
（1）工艺流程
（2）原料及配比：制作种曲的原料和配比，各地不一。目前普遍采用的两种配比为：麸皮80千克，面粉20千克，水70千克或麸皮100千克，水95千克。配方中的加水量视原料性质而定，一般凭经验用手轻捏成团，再用手指弹之即散为宜。
（3）原料处理：先用拌和机将麸皮与面粉拌匀，再加水充分拌和，即可移入锅中，常压蒸煮1小时，闷30分钟，出锅过筛，移入拌和台上摊开，适当翻拌，使之快速冷却。
（4）制种曲过程：待曲料冷却至40℃左右，接入三角瓶扩大培养菌种，用量为总料的0.1%（以干料计）。拌和均匀，使米曲霉分生孢子广泛分布于曲料上。接种完毕，装入曲盘内，轻轻摊平，厚度约2厘米。每个曲盘上盖灭菌曲盘一个，移入种曲室培养，保持室温28℃～30℃，干湿温差1℃。培养16小时左右，曲料中呈现白色菌丝，同时产生曲香味，品温升高至38℃左右，此时即可翻曲。用双手将曲料搓碎、摊平，使曲料松散，再盖上曲盘。翻曲后，种曲室内一般维持室温26℃～28℃，干湿相差1℃～2℃。翻曲后4～6小时，当品温又上升到36℃时，再进行第二次翻曲，并注意保持盖盘的潮湿，品温保持在34℃～36℃，培养50小时左右揭去盖盘。继续培养至70小时左右，孢子大量繁殖呈黄绿色，即制成种曲。
5.种曲质量检验
（1）外观检查：孢子旺盛，呈新鲜的黄绿色，具有种曲特有的曲香，无根霉（灰黑绒毛），无青霉（蓝绿色斑点）及其他异色。手指捏碎种曲有孢子飞扬，无夹心。
（2）孢子数测定：用血球计数板法测定米曲霉种曲孢子数，每克种曲孢子数以湿基计应在25亿～30亿个，干基计50亿～60亿个。摇落孢子数，种曲10克烘干后过75目筛，摇落的孢子与干物质的质量比，一般在18%左右。
（3）发芽率测定：由于测定种曲孢子数时把死孢子数也计算在内，因此当孢子测定结果符合质量标准，而在生产上却出现米曲霉生长缓慢的反常现象时，需用悬滴法测定发芽率。一般要求种曲孢子发芽率在90%以上。检验时如果发现种曲不正常，孢子发芽率低或发芽缓慢，应立即停止使用。
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