茎尖微芽嫁接法

柑橘体内除胚中不存在病毒外，茎尖中也不存在，所以离体培养成年树的茎尖可获得越过童期的脱病毒苗。茎尖微芽嫁接法主要技术流程包括砧木培养、茎尖培养（接穗繁殖）、茎尖嫁接、嫁接苗的管理。

1.材料准备及嫁接程序

（1）砧木培养将果实中充分发育的种子取出，放进纱布内包好，先在45℃左右温水中浸泡5分钟，再放入55～56℃热水中处理50分钟，取出后晾干水分。在无菌条件下，将种子浸泡在70%酒精溶液中片刻，再放入8%漂白粉澄清液或0.1%升汞水中消毒5～10分钟，然后用无菌水冲洗3～5次。剥去种皮，接种于砧木培养基上。培养基为：MS无机盐类+3%蔗糖+1%琼脂，pH5.7。培养基用25毫米×150毫米的试管分装，每管装20毫升，高压灭菌，待琼脂冷凝后即可播种。每支试管接种2～3粒种子，置于黑暗处在恒定27±2℃温度下发芽培养。待幼苗生长13～14天可作嫁接砧木。嫁接前置于室内散射光下培养1～2天。

（2）茎尖培养（接穗繁殖）从果园中结果母树上选择生长旺盛的新梢，取枝顶端约5厘米嫩梢，在室内剪成1～1.5厘米长的梢段，用自来水冲洗后在75%酒精中消毒10秒，再用8%漂白粉过滤液或0.25%安替福民或0.25%次氯酸钠溶液，加0.1%吐温20溶液消毒5分钟，以无菌水冲洗3～5次。将消毒好的嫩梢进一步去除小叶，在无菌环境中10倍双目解剖显微镜下，用解剖刀将下部叶剥掉，切取1～2毫米茎尖，带2～3个叶原基，接种在MS+BA0.25毫克/升+NAA0.1毫克/升的培养基上，亦可直接作嫁接用。

（3）茎尖嫁接程序在超净工作台无菌条件下，从试管中取出培养2周龄的砧木，切断砧木顶部以及子叶和主根，两端各留2～3厘米，在顶部切口下方0.3厘米左右处，开三角形或“U”形切口，横切一刀，平行竖切两刀，深达形成层，挑去3刀间皮层。在双目解剖镜下切取0.14～0.2厘米的茎尖，置于切口中，切面朝下与砧木的横切面紧贴。然后移栽于MS培养基中，在光照强度1500勒克斯、室温25℃条件下培养，待接芽萌发2～3片叶后，转接于一年生无毒砧木上，并套上塑料袋保湿。

（4）茎尖嫁接方法在生产中常用倒T形切接或嵌芽腹接两种。

倒T形切接法将砧木苗从试管中取出，切去过长的根，缩短至4～6厘米。切去茎的上部使上胚轴剩下约1～1.5厘米，把子叶和腋芽去掉，在上胚轴前端切出倒T形缺口，然后把事先剥好的带2～3个叶原基，长约0.2～0.4毫米的茎尖切下，立即转接到制备好的倒T形缺口上（图6.1），茎尖下切口要平，以利成活。接穗经消毒剂消毒后，残留的消毒剂必须除净，否则嫁接后接穗易发黄、变黑以至死亡。因此，接穗用无菌水反复冲洗后最好浸泡在无菌水中，随取随接，接后容易成活。在剥取茎尖时应特别小心，以免把顶端分生组织和小叶一同切掉。为避免感染病原菌的组织传染其他组织，在每次切除砧木和接穗之后，都要换用一套切割工具。在倒T形缺口处，横切一刀，接着在切线中间取0.5毫米的宽度处，朝着去顶表面切两刀，再把两刀之间的砧木去掉，一个倒T形缺口即呈现出来。嫁接时，一定要使茎尖底部和砧木切口表面形成层紧密相接。然后将嫁接好的植株转入盛有液体培养基的试管中。液体培养基为MS无机盐+维生素B₁0.1毫克/升+维生素B₆0.5毫克/升+烟酸0.5毫克/升+肌醇100毫克/升+蔗糖7.5%，pH5.7。管内放有中央开孔的滤纸架，根部穿过小孔以固定试管苗。

嵌芽腹接法方法与倒T形切接法基本相同，只是在嫁接时不切去砧木茎端，在子叶以上茎端1.5厘米处横切两刀，纵切两刀，切成小的口字形缺口，然后将茎尖接在缺口下侧横切面上（图6.2）。

2.嫁接苗的移栽及鉴定

（1）嫁接苗的移栽茎尖苗培养21～42天，至少长出2片叶，移栽前如在1000勒克斯的强光下继续照射14天，可使植株健壮。当嫁接苗展开正常叶（第一片叶长约2厘米）时，便可移栽。移栽前要对试管苗进行适当的光照锻炼，移栽时大气湿度大，温度25℃最好。移栽时用镊子将小苗轻轻取出，洗掉附着的培养基，栽于营养钵中。营养基质可选择普通苗圃土、炉灰渣、腐熟干粪（均要过筛），各占1/3混合而成。移栽时应使根系紧紧与土壤接触，土壤表面铺上一层干净的细沙，浇足MS培养液，用塑料薄膜或大烧杯罩住，以减少水分蒸发。半个月后，待新叶长出后方可去罩。移栽后应在高强度光源和27℃恒温培养室内生长1～2个月，然后移至隔离温室或网室中，使其继续生长，植株到1年半的龄期，就可开花结果。

（2）脱毒苗的鉴定经茎尖嫁接的植株是否脱去病毒、类病毒或类菌原体，需要进行鉴定。指示植物鉴定是一种常用的方法。选用敏感的表现特征症状的寄主植物作指示植物，并使指示植物在最适宜表现症状的温度环境中生长。如鉴定柑橘裂皮病用伊特洛香橼。木本植物用嫁接法接种。鉴定时需设已知毒原的正对照，以说明指示植物所处环境可以诱发病害，并设不接种的负对照，以排除其他原因引起的可疑症状。近来年，随着研究的深入，目前部分产区已经开始运用分子生物学的方法进行鉴定，如应用PCR快速检测技术进行病害鉴定。在这方面的工作上，中国农业科学院柑橘研究所处于国内领先地位，并已经在三峡库区柑橘基地率先开始进行大面积的检测。