结冷胶的摇瓶发酵

实验七　结冷胶的摇瓶发酵

一、目的要求

1.了解结冷胶的生物合成途径。

2.分析发酵过程中各参数变化的原因。

二、基本原理

1978年，Kelco公司以ATCC 31461生产结冷胶获得成功。之后，对结冷胶的分子结构、理化特性及溶液的流变特性等进行了详尽的研究。国外主要是West、Nampoothiri和Kanari等几个研究组开展了发酵法生产结冷胶的研究工作。对结冷胶发酵生产的碳源、氮源、发酵pH和温度进行了大量研究。另外，Lobas、West和Richau三个研究组分别对ATCC 31461的突变株进行了研究。目前国际上，结冷胶发酵生产中存在的主要问题是发酵培养基复杂、发酵周期长、低产率和低转化率，这使发酵生产成本高，从而阻碍了结冷胶发酵生产的进展。实现结冷胶的大规模、低成本生产在技术上需要解决的难题:对结冷胶发酵生产进行发酵动力学的研究，揭示结冷胶发酵过程中的发酵机理，通过调控关键的发酵参数优化发酵过程，提高结冷胶产率和转化率，降低生产成本。

三、器材

1.菌种:ATCC 31461。

2.试剂:葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，牛肉膏，琼脂，Na₂HPO₄，KH2PO₄，K₂SO₄，MgSO₄·7H2O，NaCl，NaOH，HCl，食用乙醇，均为分析纯，国产试剂。

3.仪器:立式蒸汽压力灭菌器，冷冻干燥机，721分光光度计，往复式摇床。

四、操作步骤

1.按照培养基配置章节里给出的培养基配方，配置好结冷胶发酵各步的培养基，并消毒灭菌备用。

2.斜面培养　将接种好的斜面放置于30℃培养箱培养24～48h。

3.液体种子培养

用接种环从斜面刮取1～2环菌体接入种子培养基（装液量为每个300mL的三角瓶装30mL培养基），置于转速为200r/min的往复式摇床，30℃培养6～16h。

4.摇瓶中结冷胶发酵

以4%～10%（体积分数）接种量将种子接入发酵培养基（装液量为每个500mL的三角瓶装100mL培养基），置于转速为200r/min的往复式摇床，30℃培养5天。

5.发酵液OD的测定

在大摇瓶发酵过程中，每隔24h取样，并将发酵液样品稀释一定倍数后，用721分光光度计在620nm条件下测定光吸收。

6.发酵液黏度测定

在大摇瓶发酵过程中，每隔24h取大约100mL发酵液，用Blankspoon黏度计测定其黏度。本章中黏度测定均使用4号转子。

7.pH测定

在大摇瓶发酵过程中，每隔24h取样，用pH计测定发酵液的pH。

8.发酵过程的曲线绘制

将取样过程中获得的OD、pH和黏度的数值，分别以取样时间为横坐标绘制发酵曲线。

五、实验报告

1.绘制三条曲线。

2.分析三条曲线之间的关系。