实验十一 5L发酵罐中结冷胶发酵
一、目的要求
掌握发酵罐的使用，并比较发酵罐发酵与摇瓶发酵的区别。
二、器材
1.主要试剂
葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，牛肉膏，琼脂，Na2HPO4，KH2PO4，K2SO4，MgSO4·7H2O，NaCl，NaOH，HCl，食用乙醇，均为分析纯。
2.主要仪器
立式蒸汽压力灭菌器，冷冻干燥机，SBA-40C生化分析仪，721分光光度计，往复式摇床，自动不锈钢发酵罐，电热恒温培养箱，Blankspoon黏度计DV-E VISCOMETER，pH计，低温离心机。
三、操作步骤
1.分批发酵
一级种子培养:用接种环从斜面刮取1～2环菌体接入种子培养基（装液量为每个300mL的三角瓶装30mL培养基），置于转速为200r/min的往复式摇床，30℃培养6～16h。
二级种子培养:以4%～10%（体积分数）接种量将培养好的一级种子接入二级种子培养基中（装液量为每个5L角瓶装1L培养基），置于转速为200r/min的往复式摇床，30℃培养4～12h。
发酵罐培养:①配制发酵培养基5L，考虑到接入的种子液的体积，所以培养基配制要适量；②将培养好的二级种子接种到发酵罐中，接种量为4%～10%（体积分数），温度30℃，发酵罐搅拌转速为100～500r/min，通风量7.5～10L/min，初始pH为7.0～7.3，中间过程不控制pH。
2.结冷胶的预处理
将0.4%（W/V）结冷胶溶液，与Sevag试剂（氯仿∶正丁醇＝1∶1，体积比）按照5∶2（体积比）混合除蛋白，并反复处理4～5次，分层后回收多糖，用无水乙醇沉淀并干燥。
除蛋白后的结冷胶溶到适量三蒸水中，进行离子交换层析。层析柱（16mm×150mm），填料为DEAESephadex A-25，上样量500mL，流速为3～4滴/分钟，10～15mL/管分部收集。2mol/L NaCl洗脱，测定每管收集液的糖含量。
3.结冷胶的测定
（1）定量检测
取一定体积的发酵液，水浴加热到80℃，用1mol/L NaOH调节至pH 10，水浴15min，然后再用1mol/L HCl调节至pH 7.0，12 000r/min离心20min，取上清液，加入三倍体积的无水乙醇沉淀，4℃过夜，8 000r/min离心15min，弃去上清液，取沉淀用冷冻干燥机干燥至恒重，用分析天平称重。
（2）葡萄糖的检测
取一定量发酵液样品适当稀释于8 000r/min离心15min，用SBA-40C测定葡萄糖的质量浓度。
（3）发酵液OD的测定
发酵液样品稀释一定倍数后，用721分光光度计在620nm测定光吸收。
（4）发酵液黏度测定
发酵过程中取大约100mL发酵液，用Blankspoon黏度计测定其黏度。
（5）菌体干重测定
取发酵液10mL加入20mL去离子水稀释，放置在80℃水浴锅中用1mol/L NaOH调节至pH 10后，水浴15min，然后再用1mol/L HCl调节至pH 7.0，12 000r/min离心20min，去上清，取沉淀，于冷冻干燥机干燥至恒重称重。
（6）pH测定
发酵过程中，用pH计测定发酵液的pH或发酵罐在线检测。
四、实验报告
计算发酵罐生产的产率，并与摇瓶发酵相比较。
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