转基因大豆---的检测

实验三　转基因大豆GTS-40-3-2的PCR检测

一、实验目的

利用PCR技术检测混合大豆样品中是否含有转基因大豆GTS-40-3-2成分。

二、实验原理

1.聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

PCR技术的基本原理（图4-4）:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）:模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

2.转基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2（Roundup-Ready soybean）是美国孟山都公司研制的抗除草剂大豆，通过外源蛋白Cp4-EPSPS表达抗除草剂的特性。近年来我国从国外进口的大豆绝大部分是这种转基因作物品种。

草甘膦（glyphosate，Monsanto公司生产的草甘膦商品名为Roundup）是一种施用于叶面的广谱的、非选择性的有机膦类除草剂。它对于一年生和多年生杂草都有极强的控制能力。草甘膦特异性地抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙酰转移酶（EPSPS）的活性。Monsanto公司将具有抗草甘膦除草剂能力的Cp4-EPSPS基因转入农作物中，使这些作物具有抗草甘膦能力。

3.本实验通过特异性的扩增大豆的内标准基因Lectin和外源35S-CTP的片段来鉴别转基因大豆GTS40-3-2和非转基因大豆。在转基因大豆GTS40-3-2中含有Lectin和35S-CTP的特异性片段，而在非转基因大豆中只含有Lectin的特异性片段，因此通过Lectin和35S-CTP特异性片段的PCR扩增进行混合大豆样品中转基因大豆GTS40-3-2成分的鉴定。

图4-4　PCR反应原理示意图

图4-5　转基因抗草甘膦大豆转质粒图谱

三、实验材料

转基因大豆GTS40-3-2

非转基因大豆

混合大豆样品A和B

四、实验试剂

植物DNA提取和纯化试剂盒

Taq　DNA聚合酶

10XPCR反应缓冲液

2mmol/L　dNTPs溶液

重蒸水

PCR引物:Lectingene:

　　　　Lectin 1F:5′GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3　3′

　　　　Lectin 2R:5′GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG　3′

　　　　扩增片段长度:118bp

　　　　35S-CTP:

　　　　35S-CTP 1F:5′TGATGTGATATCTCCACTGACG　3′

　　　　35S-CTP 2R:5′TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT　3′

扩增片段长度:172bp

琼脂糖

0.5XTBE溶液

DL2000DNA相对分子质量标记

酚-氯仿

五、实验仪器

恒温水浴锅

恒温箱

微量移液器、枪头

离心机

离心管

PTC-100PCR扩增仪

电泳仪、电泳槽

凝胶成像系统

六、实验步骤

（一）大豆样品DNA的提取和纯化

具体的实验操作步骤如下。

1.取适量样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70～100mg磨碎的样品转入1.5mL的Eppendorf管中；

2.视材料量的多少，加入600～700μL Buffer A，轻轻混匀后，65℃水浴保温10min；

3.在管中加入等体积酚/氯仿（600～700μL），上下颠倒充分混匀，抽提2min；

4.12 000g离心5min，吸取上清到一新的Eppendorf管中；

5.加入等体积Buffer B，混匀，常温放置10min后，12 000×g离心5min，弃上清液，保留沉淀；

6.在沉淀中加入60μL Buffer C，用枪头将其充分混匀（很重要）后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μL Buffer D，上下颠倒充分混匀10次后，取出离心柱，将离心柱放置在一个2mL的套管上，将溶液加入离心柱中，放置2min；

7.将离心柱和2mL套管一起用8 000×g离心，30s后，弃去2mL套管中溶液，在离心柱中加入200μL Wash BufferⅠ，8 000×g离心，30s后，弃去溶液；

8.在离心柱中加入200μL Wash BufferⅠ，8 000×g离心，30s后，弃去溶液；

9.在离心柱中加入200μL Wash BufferⅡ，8 000×g离心，30s后，弃去溶液；

10.在离心柱中加入200μL Wash BufferⅢ，8 000×g离心，30s后，弃去溶液；

11.12 000×g离心30s，以除去离心柱中痕量残余溶液；

12.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管（请自备）中，在离心柱底部中央小心加入50μL Elution Buffer，37℃放置2min后，12 000×g离心30s；

13.离心管中的溶液即可作为PCR反应的模板，建议一个PCR反应使用1μL DNA，其余样品保存在-20℃。

（二）大豆样品DNA的PCR检测

1.PCR反应体系的配制

（1）按照下表依次将试剂加入PCR反应管中:ddH₂O、10×PCR Buffer、dNTP、Primer F/R和模板DNA，最后加入一滴石蜡油，并将PCR反应液轻轻混匀。

（2）将PCR反应管置于PCR仪上，95℃10min。

（3）迅速取出PCR反应管置于冰上，加入0.3μL Taq DNA Polymerase，轻轻混匀后，于离心机中8 000×g离心15s。

（4）将PCR反应管取出，置于PCR仪上，按照预定PCR程序运行。

2.PCR反应程序

94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，35个循环；

72℃，7min

3.大豆样品PCR检测的PCR反应设置

按照下表设置进行样品的PCR扩增

（三）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

1.2%琼脂糖凝胶的配置

（1）称取2g琼脂糖，将其加入100mL的0.5XTBE溶液中，置于微波炉中充分溶解。

（2）溶解后加入5μL EB，混匀，将融好的琼脂糖凝胶溶液适当冷却，倒入凝胶槽中。

（3）充分凝固后，将其取出，即可用于电泳。

2.凝胶电泳

（1）吸取7μL的PCR反应产物，与适量溴酚蓝上样缓冲液混合后加入到凝胶加样孔中。

（2）打开电泳仪，100V电泳30min。

（3）取出凝胶，于凝胶成像系统中拍照记录实验结果。

七、实验结果与分析

1.PCR扩增结果

［注］　扩增有目的大小的条带记为“＋”，扩增没有目的大小的条带记为“-”。

2.PCR扩增结果分析

样品A中是否含有转基因大豆GTS40-3-2成分？

样品B中是否含有转基因大豆GTS40-3-2成分？

图4-6　Lectin引物PCR扩增结果示意图

Lectin引物PCR扩增结果:M:DL2000marker；A:样品A；B:样品B；

C:空白对照；D:阴性样品（非转基因大豆）；E:阳性样品（转基因大豆）

图4-7　35S-CTP引物PCR扩增结果示意图

35S-CTP引物PCR扩增结果:M:DL2000marker；

A:样品A；B:样品B；C:空白对照；

D:阴性样品（非转基因大豆）；E:阳性样品（转基因大豆）