技术分析垂体瘤中的癌基因

PCR技术进行的DNA扩增极大地推进了垂体疾病的研究进程，应用这种技术DNA可扩增100万倍，最终的扩增产物可用不同的方法进行分析，如可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙啶染色检测产物，也可以用Southern杂交的方法检测。细胞中的mRNA可以采用反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸3过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min，2～3 h就能将待扩目的基因扩增100万倍以上，所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR技术的主要优点有：①标本需求量少；②在分子生物学领域应用范围广泛；③自动化。

垂体细胞的基因突变在垂体腺瘤发生中的作用近年受到高度重视，目前，已肯定的主要为一些与细胞信号转导有关的基因的点突变，这些基因包括G蛋白Gs的α亚单位（Gsα）基因、ras原癌基因、蛋白激酶C（PKC）的α亚型基因等。Gsα是最先明确与垂体腺瘤有关的基因，这方面的研究始于20世纪80年代中期，当时有人发现约1/3的GH腺瘤腺苷酸环化酶（adenosine cyclase，AC）活性及cAMP水平升高且不受GHRH和霍乱毒素（可通过刺激Gs而激活AC）的调节。稍后的研究证实：GH瘤细胞内AC的激活乃Gsα的突变所致。Gsα有2个突变热点，其一使201位精氨酸变成半胱氨酸或组氨酸；另一使227位谷氨酰胺变成精氨酸或亮氨酸。此2位点对于Gsα的GTP酶活性极为重要，突变使得Gsα的GTP酶活性下降，导致Gs信号系统持续地处于激活状态，于是cAMP产生增加。在垂体细胞，cAMP不仅与激素的合成和释放有关，而且参与细胞的增生。Yoshimoto等发现4/53例的垂体瘤、一小部分的甲状腺肿瘤和肾上腺皮质肿瘤中存在Gsα突变体，而对照的其他内分泌肿瘤，包括甲状旁腺肿瘤、胰腺内分泌肿瘤和嗜铬细胞瘤都不存在Gs基因突变，揭示了只有特异的内分泌肿瘤才存在Gs基因突变，而并不是所有的内分泌肿瘤都存在这种突变体。有人发现，霍乱毒素转基因小鼠的垂体出现增生，说明Gs信号系统的激活确实可引起垂体细胞的增殖。目前已知，约40%的GH腺瘤和约10%的无功能垂体腺瘤与Gsα的突变有关。Gsα基因现已被视为原癌基因，称为gsp，其突变被视为垂体腺瘤发生的早期事件。Gi也是一种G蛋白，其功能与Gs相反。Gi的突变亦与垂体腺瘤有关。有人在32例ACTH瘤中发现2例，22例无功能垂体腺瘤中发现3例有Giα亚单位的突变。Giα也已被视为原癌基因，称为gip。其他G蛋白与垂体腺瘤的关系尚不清楚。

对GH垂体瘤的gsp突变研究发现，GHRH能够强烈刺激gsp阴性肿瘤，一部分gsp阴性肿瘤的磷脂酰基醇更新明显增高，提示部分亚型的gsp阴性的GH垂体瘤存在这种第二信使系统的缺陷。

PKC是一类在细胞信号转导中发挥重要作用的蛋白激酶。Alvaro等发现，垂体腺瘤组织的PKC表达水平较正常垂体组织高；侵袭性垂体腺瘤PKC的表达更高。他们还发现一些侵袭性垂体腺瘤的PKCα有突变，使其294位天冬氨酸变成甘氨酸，这一突变位点正好位于PKCα分子的V3区，此区含有Ca2+结合位点，上述突变导致PKCα过度激活。PKC可调节细胞外多种蛋白酶、胶原酶的活性，PKC活性的升高可促进肿瘤向正常组织的浸润。故目前认为，PKCα的突变与垂体腺瘤的侵袭性有关。

PCR技术也可以用来研究垂体腺中的下丘脑释放激素，应用此技术检测到大鼠的腺垂体中有促性腺激素释放激素（GnRH）的mRNA的存在，在人体的垂体腺中也存在GHRH的mRNA，这与ISH检测到的人类垂体瘤中GHRH mRNA的表达是一致的。PCR技术对于分析垂体激素基因的分子杂合性也有帮助，分离型的GHⅠa缺陷型是由于GH-1基因缺失引起的，研究者证实3段缺失长度的差异，证明了GH-1基因缺失的杂合性，他们报道的所有缺失部位和长度与以前Southern杂交获得的结果互相印证。在严重的发育迟缓的患者中应用PCR技术检测到GHⅠa基因缺陷，对7例严重发育迟缓中国人的病例对照研究中，发现了2例患有分离型的GHⅠa缺陷，提示这种方法可用于对严重发育迟缓患者的GHⅠa基因缺陷型进行早期的筛查，以便早发现、早治疗。

ISH和PCR技术联合应用可以使形态学家来识别细胞内低浓度的信息，不同的实验室正采用这种方法对垂体瘤进行深入的研究，原位反转录（RT）PCR可以在冷冻的组织切片上进行，这可以在原位对遗传的信息进行放大，并且对信息进行定位，这两种技术是未来垂体瘤研究中不可缺少的技术。