如何根据引物查找病毒基因序列

(一)细菌的种属鉴定和鉴别诊断

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定亦从传统的表型分类进入到各种基因型分类，常用分类方法有(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。

细菌的核糖体RNA(rRNA)分子在生物体中普遍存在，其一级结构中既含有保守的片段，又含有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中，rRNA分子在保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序的同时，也存在着与进化过程相一致的突变，在结构上可分为保守区和可变区，保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则表明了物种间的差异。那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物(如科、属、种)鉴定的分子基础，研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生关系。

细菌rRNA按沉降系数分为5S、16S和23S rRNA3种。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16S rRNA长约1 540bp，结构和碱基排列复杂度适中，较易进行序列测定和分析比较。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA的DNA序列，其内部结构由保守区和可变区两部分组成，存在于所有细菌染色体基因中。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品是否存在某些细菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的细菌。近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16S rRNA进行研究，得到了细菌的16S rRNA序列库。

23S rRNA基因的变异性高于rRNA基因中其他基因，其变异性更适合应用于临床常见致病微生物的鉴别诊断。国内外常选取该基因的保守序列进行基因扩增，比较不同细菌间的种属差异，用于细菌的鉴别诊断。但由于不同细菌的23S rRNA基因库尚未完全建立，这直接影响运用该基因进行细菌的鉴别诊断。在实际应用过程中，由于该片段在不同细菌种属中的变异性不同，在部分种属间无法进行分型，所以尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用。

现在人们已经认同16S rRNA基因序列可用于评价生物的遗传多态性和系统发生关系，可作为细菌分类学中一个科学可靠的指标。在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时，由于分离培养技术的限制，难以获得纯培养进行其生理、生化学指标的分析，此时16S rRNA序列分析的优越性就体现了出来。

16S rRNA基因片段分析方法的基本步骤：根据已知基因序列的16S rRNA基因的同源性比较结果，设计并选取一对扩增16S rRNA基因的通用引物，PCR扩增该基因片段，产物纯化后对扩增片段进行限制性内切酶酶切分析(PCR-RFLP)、序列测定，运用生物分析软件，分别进行不同种属间16S rRNA基因的同源性比较，比较结果绘制成系统发育树分析表，以分析细菌在种系分类上的进化关系及细菌鉴别诊断中的意义。

16S-23S rRNA基因是位于16S rRNA基因与23S rRNA基因之间的区间序列，具有保守性和可重复性，被认为是细菌鉴定的合适部位。国外研究已经证实16S-23S rRNA基因的进化率要强于16S rRNA基因10倍，因此，用16S-23S rRNA基因区间来区分不同的细菌更具优势。

(二)耐药基因的检测

耐药基因的检测多以聚合酶链反应为基础，直接进行标本检测，从而快速、早期地为临床选择抗菌药物提供依据。目前，一些生物公司也提供基因芯片检测服务，包括针对重要的革兰阳性致病菌的菌种鉴定及其18种耐药基因的检测、革兰阴性肠杆菌科致病菌的9种耐药基因的检测，并可设计与现有平台相接近的引物或基因芯片，建立实验方案。