产物的检测方法

PCR扩增完成之后，必须通过严格的检测分析，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。PCR产物的检测，可依据研究对象和目的的不同而采用不同的分析方法。判断PCR的有效性和正确性可通过对PCR产物进行电泳分离，观察扩增条带有无、扩增片段的大小而实现。如果要了解扩增产物的序列是否正确，则必须对产物作进一步分析。

(一)凝胶电泳

凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能迅速判断有无预期大小的扩增产物。DNA在电泳缓冲液(偏碱性)里带负电荷，在电场作用下，从凝胶的负极向正极泳动。DNA分子凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段>100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。

1.琼脂糖凝胶电泳　这是实验室最常用的检测PCR产物的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于速度不同而被分离，经溴化乙锭(EB)染色，在紫外线照射下DNA分子发出橙红色荧光而判定其分子的大小。不同浓度的琼脂糖凝胶分辨线性DNA的有效范围不同(表4-1)。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N，N′-甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：①分辨率很强，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；②能装载的DNA量大，达每孔10μg DNA；③回收的DNA纯度高；④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2～5倍；⑤避免了EB迅速褪色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。其浓度与线性DNA有效范围关系如表4-2所示。

表4-1　琼脂糖浓度与分离DNA分子的有效范围

表4-2　丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围

(二)限制性片段长度多态性分析

限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)的原理是利用限制性核酸内切酶识别并剪切特定DNA序列的能力，检测基因片段上该酶识别位点处是否存在核苷酸突变，识别位点处核苷酸的改变将导致原酶切位点的消失或产生新的酶切位点，使得酶切后片段大小发生变化，通过琼脂糖凝胶电泳即可判断有无突变发生。PCR和RFLP的结合加快和简化了分析的过程，得到广泛的应用。但是，PCR-RFLP也有一定的局限性，并不是基因片段中任意核苷酸的变化都能引起相应限制性核酸内切酶识别位点的改变，而且相隔很近并同时发生的点突变都导致此种方法无从入手。此法主要用于传染病病原体基因分型和人类基因变异性的研究。

(三)分子杂交法

杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。检测PCR扩增产物常见的杂交方法有点杂交、反向点杂交、微孔板夹心杂交、Southern印迹杂交以及RNA探针杂交酶免分析等。分子杂交技术详见第5章。

(四)PCR-寡核苷酸连接试验法

寡核苷酸连接试验(oligonucleotide link assay，OLA)是为检出单一核苷酸的突变而设计的，它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序列。OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确配对杂交的寡核苷酸完成的。寡核苷酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5′端修饰技术使一个寡核苷酸5′端带有一个碱基，连接后通过固相化的亲和碱基使其固定，漂洗后检测另一寡核苷酸3′端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称此循环进行的OLA为连接检测反应。

(五)单链构象多态性

单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)的基本原理是，将PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)经变性处理成单链DNA(ssDNA)，加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。单链DNA构象的变化将引起其在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel eleceophoresis，PAGE)中迁移率的改变，而单链DNA的构象与一级序列密切相关。因此，DNA一级序列的轻微改变都能在PAGE电泳中表现出来。通常，将待检测DNA片段通过PCR扩增及产物变性后进行SSCP分析，引入适当的对照比较电泳结果就可以确定发生突变的样本。

PCR-SSCP的主要优点相对简单，可用于分析各种类型的基因突变。如缺失、插入和点突变。该技术的不足之处是可能漏检一些突变，因为不同的DNA一级序列组成、PAGE电泳条件及PCR产物大小对检测灵敏度都有一定的影响。DNA片段中A、G含量丰富的链比C、T含量丰富的链对碱基的改变更敏感。改变凝胶的浓度有时也可以提高检测单个碱基改变的灵敏度。随着PCR产物片段长度的增加，突变对它们在电泳中迁移率改变的影响逐渐减小。因此，根据经验，SSCP方法仅适合于300bp以内的PCR产物，对于大片段DNA突变的检出率较低。

(六)异源双链分析

异源双链分析(hereroduplex analysis，HA)与SSCP方法相似，该法利用PAGE作为扩增后的分析手段。所谓异源双链是指PCR扩增中由突变型和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子。它与同源双链在PAGE电泳中呈现不同的电泳速率，从而将野生型和突变型双链DNA分开，从而达到检测基因突变的目的。与SSCP一样，随着PCR产物片段长度的增加，突变对它们在电泳中迁移率改变的影响逐渐减小，HA法仅对300bp以内DNA的突变检测效果较好。

(七)测序法

测序法是将PCR产物经克隆后测序或直接对PCR产物进行测序，是所有检测方法中最灵敏、最全面的。但是，测序法所需的仪器和高昂的费用使得它并没有在临床诊断中得到普及，多用于研究工作。DNA测序技术详见第6章。

(八)PCR-ELISA法

因为引物5′端修饰后不影响PCR扩增，因此可以通过修饰一条引物的5′端使其携带便于产物固定的功能基团(如标记生物素，可使产物与固定于包被板上的亲和素结合)，另一引物5′端标记另一显色基团(如标记FITC，用HRP标记的抗FITC结合显色)，以使产物便于检测。该法省去了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA计数仪检测。