在PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利弊，可与PCR互为补充或结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。
1.连接酶链反应 连接酶链反应(ligase chain reaction，LCR)是在连接酶扩增反应或连接酶检测反应的基础上，引入耐热连接酶而建立的类似PCR技术的新方法。LCR的扩增效率与PCR相当，其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用于点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。LCR的基本原理为利用DNA连接酶的特性，即可以特异地将与靶序列完全互补的相邻两条DNA单链连接在一起，然后经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶序列大量扩增。在模板DNA、DNA连接酶、引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度(94～95℃)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增。若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物(图4-19)。其中，LCR的引物是两对分别互补的引物，并与靶序列相邻的区域结合。LCR识别点突变的特异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性，LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高。
2.随机扩增多态性DNA 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNAs，RAPD)是以PCR为基础，由一系列人工随机合成的寡核苷酸链(通常为10bp)为引物，以所研究的整个基因组DNA为模板进行的PCR扩增。与PCR相比，其特点是用一组随机序列的引物与模板DNA做随机配对，反应过程中随机引物只有在与模板DNA互补后，在足够近的间距(200～2000bp)内，方向相对的两个引物片段之间的模板DNA序列才能被扩增。当不同个体DNA序列之间存在差异或发生突变，经扩增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分离便可以发现这种差异，从而可了解和比较两个生物体(不同物种之间或同一物种不同个体之间)基因组DNA的结构等信息。
3.核酸序列依赖扩增 核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一种等温扩增RNA的技术，它能直接扩增单链RNA特异序列，通过合成cDNA的中间环节，在等温条件下进行体外序列特异性核酸扩增，主要用于RNA的扩增、检测和测序。与PCR相比，其特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环，整个反应过程由3种酶控制，循环次数少，忠实性高，其扩增效率高于PCR，特异性好。
图4-19 连接酶链反应原理
NASBA反应有赖于AMV反转录酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作完成，此外还含有dNTP、NTP、两种特殊的引物和缓冲液。引物1的3′末端与靶序列互补，5′端含有T7RNA多聚酶的启动子，这一引物用于合成cDNA。引物2与cDNA的5′末端互补。其基本原理：首先引物1与RNA模板复性，AMV反转录酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一条单链的DNA；引物2随即与此cDNA的5′末端结合，反转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链。这样形成的双链DNA含有T7RNA多聚酶的启动子。T7RNA多聚酶即以此双链DNA为模板转录出与模板RNA序列相同的RNA链，每条新的RNA又可作为反转录酶的模板合成cDNA。如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA(图4-20)。
图4-20 核酸序列依赖扩增原理
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