试剂和检测方法

选用的PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而又极为关键的。试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制诸多因素的影响，原料的质量、方法学、程序设置、运输和储存等一系列环节都对试剂盒的质量有着决定性的影响。因此，操作者在使用这些试剂盒时要进行质检。

PCR试剂盒大都由核酸提取试剂、核酸扩增试剂和产物检测试剂三种组成。影响PCR试剂盒质量的因素主要分为内在因素和外在因素。内在因素包括标本处理方法、核酸扩增的原材料及方法学设计等等。由于临床标本中常含有蛋白及脂类等干扰PCR扩增的物质，因而进行核酸提取是进行PCR扩增前必不可少的一部分。外在因素则主要是试剂盒出厂以后在运输和储存过程中出现的问题。在适当的储存温度下，PCR试剂盒的有效期一般为6个月。核酸扩增部分的试剂一般要储存于-20℃以下；提取试剂一般保存于2～8℃。如果储存温度不当，则会影响PCR试剂盒的使用有效期。试剂盒从生产厂家到实验室使用者手中要经历运输等诸多环节，任一环节的不当，例如在运输时反复冻融，则会使试剂盒的试剂质量受到影响，从而影响试剂盒的临床使用质量。

组成一个可用于临床分子诊断的试剂和方法模式，可有多种选择，如PCR因其极高的检测灵敏度，很容易因扩增产物或标本间交叉污染，而出现假阳性结果。此外，标本中PCR抑制物的存在、扩增仪孔间温度的差异、试剂的浓度不合适以及标本中核酸提取的失败等，则容易造成假阴性结果。因此，试剂生产厂家在研发相应的临床分子诊断试剂时，必须仔细考虑上述因素，采用最理想的检测方法。如PCR试剂则应从如何有效避免假阳性和假阴性结果的角度出发，在试剂盒中以dUTP替代4种dNTP中的dTTP，再加上尿苷糖基酶(UNG)，使扩增产物片段中出现天然DNA中所没有的U，在新的检测扩增中，如有以前扩增产物的污染，则其可在UNG的作用下被降解。这样可一定程度地避免以前扩增产物的污染所致的假阳性。又如在试剂中加入竞争性或非竞争性内标，则可有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。