细菌耐药性机制

细菌对抗菌药的耐药性机制是生物医药研究的重要领域，对抗菌药耐药机制研究在多方面也有许多新的重要的发现。如超广谱β－内酰胺酶（ESBL）及新型β－内酰胺酶的出现；对金黄色葡萄球菌耐药机制的进一步认识与发现；新型抗多重耐药革兰阳性球菌的Platen－simycin，鲍曼不动杆菌基因多重“耐药岛”的发现；对细菌药物主动外排泵的药物转运结构机制的深入了解及发现新的药物泵或新的泵调控表达机制，发现了喹诺酮类药物修饰酶、质粒介导的喹诺酮耐药性在世界范围内的出现。提示细菌对不同抗菌药的多种耐药保护机制及细菌本身基因结构的多样性与可移动性，使其能进化产生新的耐药机制，以适应抗菌药的作用。因此，合理地应用抗菌药以最大限度地减少细菌耐药性发生，及传播和延长抗菌药的疗效周期，是人类所面临的长期挑战。

细菌在对抗抗菌药物的过程中，为了免遭伤害，形成了多种防卫机制，由此产生的耐药菌得以存活和繁殖。很多细菌对某种或多种抗菌药具有耐药性，且具有多种耐药机制。

1．耐药机制　细菌对抗菌药产生耐药性的可能机制主要有以下几种。

（1）抗菌药被细菌产生的酶灭活：细菌产生1种或多种水解酶或钝化酶，水解或修饰进入细菌细胞内的抗菌药，使之失去生物活性。细菌产生的灭活酶有水解酶和合成酶。

①水解酶：如β－内酰胺酶，可将青霉素类和头孢菌素类药物分子结构中的β－内酰胺环打开使药物失效。

②合成酶（钝化酶）：如乙酰化酶、磷酸化酶、核苷化酶等，可将相应的化学基团结合到药物分子上使药物灭活。如氨基糖苷类抗菌药物钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和MSL（大环内酯类－林克霉素类－链阳菌素类）类抗菌药钝化酶。

（2）抗菌药作用靶位的改变：由于抗菌药作用靶位（如核糖体和核蛋白）发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药无法发挥作用，以及抗菌药的作用靶酶（如青霉素结合蛋白和DNA回旋酶）结构发生改变，而使之与抗菌药的亲和力下降。

改变药物作用靶位包括：①耐药的细菌可改变靶蛋白结构使药物不能与靶蛋白结合，如细菌对利福霉素的耐药；②增加靶蛋白的数量，如金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药；③生成新的对抗生素亲和力低的耐药靶蛋白，如耐甲氧西林金葡菌对β－内酰胺类抗生素产生的耐药。

（3）由于细菌细胞膜渗透性的改变，而使抗菌药无法进入胞内；或其他有关特性的改变如形成细菌生物被膜，为细菌躲避抗菌药作用提供场所。如细菌对β－内酰胺类抗生素、四环素、氯霉素等的耐药，由于细菌外膜结构改变，孔蛋白构型改变或缺失，降低细胞膜的通透性，导致药物不易渗透至菌体内。

（4）细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制，即有些耐药的细菌具有主动转运泵，它能够将已经进入细菌胞内的药物泵至胞外。这是获得性耐药的重要机制之一。

（5）细菌改变代谢途径：如细菌对磺胺药的耐药，通过产生大量的对氨苯甲酸（PABA），或直接利用叶酸生成二氢叶酸。

耐药性也可以是以上几种机制的结合。其中（1）和（2）具有很强的专一性，即这些细菌仅对某种或某一类抗菌药物产生耐药性；而（3）和（4）是非专一性的，即具有这两种耐药机制的细菌对不同结构类别或不同作用机制的抗菌药都能产生耐药性。

2．β－内酰胺类药物的耐药机制　随着β－内酰胺类的广泛使用，耐药菌也越来越多，耐药机制涉及以下几种途径。

（1）产生β－内酰胺酶：β－内酰胺环为β－内酰胺类抗菌药的活性部位，一旦被β－内酰胺酶水解，就将失去其抗菌活性。细菌对β－内酰胺类抗菌药的耐药约80%通过产生β－内酰胺酶实现。β－内酰胺酶种类繁多，它通过与β－内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键而使β－内酰胺类失活。具有不同特性的β－内酶胺酶的细胞对不同结构的β－内酰胺抗菌药物的耐受性不同。革兰阳性菌、革兰阴性菌、诺卡菌和分枝杆菌中都发现有各种不同特性的β－内酰胺酶。针对这一耐药机制，临床上目前应用的药物有两类：具有对β－内酰胺酶稳定的化学结构的药物，包括甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、异唑青霉素等半合成青霉素，以及亚胺培南、美洛培南等碳青霉烯类等。β－内酰胺酶抑制药克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等，与β－内酰胺类药物联用，对产酶菌有很强的增效作用。复合制剂有阿莫西林＋克拉维酸（奥美汀），羧苄西林＋克拉维酸（替门汀），氨苄西林＋舒巴坦（舒氨西林），头孢哌酮＋舒巴坦，哌拉西林＋他唑巴坦等。

产生β－内酰胺酶是革兰阴性菌耐β－内酰胺类的主要机制，已报道了400种以上的由质粒或染色体编码的β－内酰胺酶，包括传统的OXA、PSE、SHV及TEM型酶与新近发现的酶类型如CTX－M、GES、IMP、KPC、LEN、OKP、PER、VEB及VIM等。耐药菌常可同时表达多种β－内酰胺酶，而且日益增多的酶类已从过去主要分布于医院病原菌开始扩散到社区获得感染的病原菌，给β－内酰胺类的应用带来了严重威胁，也导致住院费用与病死率明显提高。CTX－M型酶是TEM与SHV类以外的最常见的超广谱β－内酰胺酶（ESBL）。

1990年，Ambler根据各自的氨基酸序列的不同将酶分为A、B、C、D共4类，A、C、D类酶活性位点为丝氨酸，B类酶活性基团为锌，其中，A、D类酶可被酶抑制药所抑制。4种分子类别的β－内酰胺酶，按照各自的底物、抑制药及分子结构分为4组。第1组是不被β－内酰胺酶抑制药克拉维酸抑制的头孢菌素酶；第2组为可被克拉维酸抑制的β－内酰胺酶，为数量最多的一组；第3组酶的作用需要金属离子如Zn2＋的参与，故称为金属β－内酰胺酶，它不被克拉维酸抑制，但可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制；第4组包括少量青霉素酶，不被克拉维酸抑制，主要由染色体介导。对由于产灭活酶或钝化酶而出现耐药的细菌，可应用对酶有一定稳定作用的药物联合应用酶抑制药或换用其他敏感的抗菌药。针对产生β－内酰胺酶的细菌，可应用相对能抵抗β－内酰胺酶水解作用的抗菌药，如甲氧西林、苯唑西林等均能对抗金黄色葡萄球菌产生的青霉素酶，羧苄西林具有抗Ⅰ型染色体介导产β－内酰胺酶铜绿假单胞菌活性。其中重要者为第Ⅰ和Ⅱ型。

超广谱β－内酰胺酶（extended spectrumβ－lactamases，ESBLs）主要由肠杆菌科细菌如肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌等细菌产生，ESBLs大部分由质粒介导，对甲氧亚氨基β－内酰胺类抗菌药物（如头孢他啶、头孢噻肟）及单氨类抗菌药物如氨曲南等药物一种或多种耐药。有效药物仅有碳青霉烯类、头霉素类、氧头孢烯类、β－内酰胺酶抑制药复合制剂等。

革兰阴性杆菌中高水平表达的染色体介导的AmpC酶已渐成为临床上面临的严重治疗问题。AmpC酶为不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶，可引起革兰阴性杆菌对第三代头孢菌素、单环类抗生素、头霉素类、氧头孢烯类、β－内酰胺酶抑制复合制剂耐药。有效的药物包括碳青霉烯类、第四代头孢菌素、其他非β－内酰胺类抗生素。

第Ⅰ型酶分为由染色体介导产生的AmpC型β－内酰胺酶和由质粒介导产生的AmpC型β－内酰胺酶，前者的产生菌有阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌等，后者主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产生。第Ⅰ型酶主要作用于大多数青霉素，第一、二、三代头孢菌素和单环类抗生素。而第四代头孢菌素、碳青霉烯类不受该酶作用。该酶不能被β－内酰胺酶抑制药所抑制。

AmpC型β－内酰胺酶的产生有2种可能：①在诱导药存在时暂时高水平产生，当诱导药不存在时，酶产量随之下降；②染色体上控制酶水平表达的基因发生突变，酶持续稳定高水平产生。由这种耐药菌引起的感染病死率很高。

以前认为第2组细菌（肠杆菌属）只产生典型的AmpC型β－内酰胺酶，但目前的一些研究提示，它们也能产生第Ⅱ型酶，即超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）。第Ⅱ型酶是由质粒介导产生的ESBLs（TEM－1、TEM－2和SHV－1的变异等8种亚型），主要由肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等产生。但该酶可被β－内酰胺酶抑制药所抑制。ESBLs可将耐药质粒以转化、传导、整合、易位、转座等方式传播给其他细菌，从而导致多种细菌产生耐药性。一项肺炎克雷伯菌的研究发现，216株细菌中2株产生ESBLs（14．8%），用过第三代头孢菌素的患者产生ESBLs肺炎克雷伯菌的分离率比未用过的患者明显增高（31%比3%，P＜0．01），说明第三代头孢菌素与ESBLs的产生密切相关。有人认为第三代头孢菌素类抗生素的滥用是引起这类耐药细菌出现的主要因素，调查还发现，β－内酰胺酶抑制和亚胺培南类药物不易诱导ESBLs产生。

嗜麦芽窄食单胞菌具有多重耐药性，除因外膜微孔蛋白低拷贝所致外膜通透性下降及通过主动外排系统将药物泵出胞外，产生染色体介导的2种金属β－内酰胺酶（L1与L2）是其最主要的耐药机制。此两种酶可水解包括碳青霉烯类的β－内酰胺类抗生素，对氨基糖苷类、氟喹诺酮类等大多高度耐药，敏感性较高的仅有复方磺胺甲唑（SMZ CO）、替卡西林／克拉维酸、环丙沙星、头孢哌酮／舒巴坦等。

另外，由于多类抗菌药广泛地应用于治疗或控制食用动物或宠物的细菌感染性疾病，部分抗菌药还被用于食用动物的促生长制剂，动物细菌超广谱β－内酰胺酶也引起关注。近几年动物分离耐药菌所产的ESBL主要是CTX－M型酶类，其次有TEM和SHV型酶。令人关注的是CTX－M型酶类作为较新的β－内酰胺酶在近几年也在人类细菌中发现。

（2）药物作用的靶蛋白改变：β－内酰胺类抗菌药物的作用靶位为青霉结合蛋白（PBP），对耐药菌除了由于产生大量β－内酰胺酶，破坏进入胞内的抗菌药物外，还由于PBP发生了改变，使之与药物的亲和力降低，或是出现了新的PBP所致。这种耐药机制在金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌等耐药菌中均已证实。

改变抗生素与PBP的亲和力，改变参与细菌细胞壁合成的蛋白酶的分子结构，从而降低它们与β－内酰胺类抗生素的亲和性。β－内酰胺类抗生素的抗菌活性是根据其与PBP的亲和力强弱决定的，当与PBP结合后，使PBP丧失酶活性，使细菌细胞壁的形成部位破损而引起溶菌；反之，则成为耐药菌。PBP基因的变异，使β－内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，是形成耐药的根本原因。PBP1A、PBP2X、PBP2B的基因排序已经证明1～3个位点基因变异，位点变异造成PBP结构变化，使抗生素不易与之结合，使其之间的亲和力下降，导致抗菌力低下。

（3）细胞外膜渗透性降低：细菌的细胞膜使细菌与环境隔离开，细胞外膜上的某些特殊蛋白即孔蛋白是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性物质扩散通道。一些半合成的β－内酰胺类抗菌药很容易透过肠细菌的孔蛋白通道；但一些具有高渗透性外膜的对抗菌药敏感的细菌，可以通过降低外膜的渗透性产生耐药性，如原来允许某种抗菌药通过的孔蛋白通道，由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失。细胞膜和细胞壁结构的改变，使药物难以进入细菌体内，引起细菌体内药物摄取量减少而使细菌体内药物浓度低下。如生物膜形成，使抗生素无法进入细菌体内。细菌就会对该抗菌药产生很高的耐药性。亚胺培南是一种非典型的β－内酰胺类抗菌药，其对铜绿假单胞菌的活性主要通过一个特殊的孔蛋白通道OprD的扩散而实现的，一旦这一简单的孔蛋白通道消失，则铜绿假单胞菌对亚胺培南就会产生耐药性。事实上，已经确实分离到具有这种耐药机制的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌。

（4）主动外排：细菌的能量依赖性主动转运机制能将已经进入细菌体内的抗生素泵出体外，降低了抗生素吸收速率或改变了转运途径，也导致耐药性的产生。

3．氨基糖苷类药物的耐药机制

（1）产生钝化酶：对氨基糖苷类耐药的细菌，其主要耐药机制是产生各种不同的钝化酶。与β－内酰胺酶机制不同，氨基糖苷类钝化酶是对这些抗菌药物分子中某些保护抗菌活性所必需的基团进行修饰，使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低。这些钝化酶包括氨基糖苷酰基转移酶（AAC）、氨基糖苷腺苷酰基转移酶（AAD）、氨基糖苷磷酸转移酶（APH）、腺核苷转移酶（ANT）等。已经在许多氨基糖苷类的耐药菌中发现了不同特性的钝化酶。

当氨基糖苷类抗生素依赖电子转运通过细菌内膜而到达胞质溶胶中后，与核糖体30S亚基结合，但这种结合并不阻止起始复合物的形成，而是通过破坏控制翻译准确性的校读过程来干扰新生链的延长。而异常蛋白插入细胞膜后。又导致通透性改变，促进更多氨基糖苷类药物的转运。氨基糖苷类药物修饰酶通常由质粒和染色体所编码，同时与可动遗传因子（整合子、转座子）也有关，质粒的交换和转座子的转座作用都有利于耐药基因掺入到敏感菌的遗传物质中去。氨基糖苷类药物修饰酶催化氨基糖苷类药物氨基或羟基的共价修饰，使得氨基糖苷类药物与核糖体的结合减少，促进药物摄取EDP2也被阻断，因而导致耐药。根据反应类型，氨基糖苷类药物修饰酶有N－乙酰转移酶（N－acetyltransferases， AAC）、O－核苷转移酶（O－nucleotidyltransferase，ANT）和O－磷酸转移酶（O－phosphotransferases，APH）。这些酶的基因决定簇即使在没有明显遗传关系的细菌种群间也能传播。AAC以乙酰辅酶A为供体，乙酰化氨基糖苷类药物的1、3、6′、2′位氨基，而APH和ANT两者均以ATP为供体，APH作用于氨基糖苷类药物的3位－OH和4位（潮霉素Hygromycin，HygB）、3″（链霉素Streptomycin，Sm）和6位（Sm）－OH，ANT作用于氨基糖苷类药物的2″、4′位－OH和3″位（Sm和大观霉素Spectinomycin，Spcm）、6位（Sm）、9位（Spcm）－OH使之磷酸化，从而使氨基糖苷类药物钝化。

目前，临床上使用的许多半合成氨基糖苷类都是根据细菌产生点耐药性的机制进行结构改造得到的。如阿米卡星是在卡那霉素分子中引进保护基团以免钝化酶修饰；或地贝卡星是去除钝化酶修饰的基团；或是两者皆有，如阿贝卡星。

（2）核糖体结合位点发生改变：临床分离到的许多对氨基糖苷类产生耐药性的细菌主要是通过细菌产生的各种钝化酶的修饰作用来实现的。但结核分枝杆菌对链霉素的耐药是由于链霉素的作用靶位16S核糖体的某些碱基发生了突变，或是与核糖体结合的核蛋白16S的某些氨基酸发生了突变。

链霉素作用于核糖体30S亚基，导致基因密码的错读，引起mRNA翻译起始的抑制和异常校读。大量研究表明，编码S12核糖体蛋白的rplS基因及编码16SrRNA的rrs基因突变都会使核糖体靶位点改变，使细菌对链霉素产生显著水平的耐药。S12蛋白是30S亚基中的一个组分，主要控制链霉素与30S亚基的结合，它可以稳定由16SrRNA所形成的高度保守的假节结构，Rpsl中氨基酸的置换将会影响16SrRNA的高级结构，导致对链霉素的耐药，而16SrRNA结构的改变又破坏了16SrRNA与链霉素的相互作用。

（3）药物摄取的减少：药物摄取的减少主要是由于膜的通透性降低所引起，而基因突变可导致膜的通透性降低，可使能量代谢如电子转运受到影响而减少氨基糖苷类药物的吸收；也可使药物的转运系统缺损而减少药物的摄取量。氨基糖苷类药物通过寡核系统转运至体内，寡核结合蛋白（oligopeptide binding protein，OPPA）是寡核转运系统的重要组成部分，而大肠埃希菌耐卡那霉素突变株的OPPA数目明显减少，有的突变株甚至不含OPPA。前者是因为在翻译水平上OPPA发生了OPPA合成的减少，后者则是由于编码OPPA的基因OPPA发生了无义突变。

（4）主动外排：主动外排系统作为细菌耐药机制之一，存在于许多细菌中。细菌的主动外排系统主要分为四大类：①主要易化超家族（major facilitate or superfamily，MFS），与哺乳动物的葡萄糖易化转运器具有同源性；②耐药结节分化家族（resistance－nodulation division family，RND），包括能够泵出镉、钴和镍离子的转运蛋白；③葡萄球菌多重耐药家族（staphylococcal multidrug resistance family，SMR），由比较小的含有四个跨膜螺旋的转运器组成；④ATP组合盒（ATP－binding cassette，ABC）转运器，包括两个跨膜区和两个ATP结合亚单位。Edger等从大肠埃希菌中克隆到一个MDR基因mdfA，它可编码410个氨基酸残基的推定膜蛋白MdfA，这种新的多药转运蛋白属于MFS型转运蛋白，由质子电化学梯度驱动，具有输出新霉素、卡那霉素的活性。

4．大环内酯类药的耐药机制

（1）产生钝化酶：在乳杆菌中发现有大环内酯类的钝化酶存在，但对其作用机制和相应的基因结构等了解不多。从患者的血液中分离到含有红霉素钝化酶的大肠埃希菌，所有耐红霉素的大肠埃希菌中都存在红霉素酯酶，这些酯酶能酯解红霉素和竹桃霉素的大环内酯部分。同时。这些酯酶似乎专一性地作用于14元环的大环内酯类药物，因为它们对交沙霉素、麦迪霉素、螺旋霉素没有作用。

（2）细菌作用靶位发生改变：大环内酯类药物因其安全、有效，已在临床上应用40余年，占据口服抗生素的主导地位。但随着大环内酯类药物的广泛使用，细菌对其耐药也日趋严重。细菌对大环内酯类药物的耐药机制主要有：①erm基因编码靶位点甲基化修饰；②药物的主动外排机制；③核糖体突变；④抗生素灭活酶的产生等。

因大环内酯类抗菌药物、林可霉素及链阳菌素的作用部位相仿，所以耐药菌对上述三类抗菌药物常同时耐药，称为MLS（macrolide，lincosamide，streptogramins）耐药。

①erm基因介导靶位点修饰：对临床分离得到的耐红霉素肺炎链球菌的研究发现，耐药性的产生是由一种质粒介导的甲基化酶的产生所致，从而使进入胞内的抗菌药物不能与之结合而失去作用。erm基因编码核糖体甲基化酶，可使细菌23SrRNA A2058位点的腺嘌呤残基N26位二甲基化。A2058是红霉素结合于细菌核糖体的关键位点，此位点的修饰可显著降低红霉素与细菌的结合。由于林可霉素、链阳性菌素复合物、大环内酯类三类抗生素与细菌rRNA的结合位点存在较大的重叠区域且关键位点均为A2058，因此erm基因不仅能影响大环内酯类抗生素如红霉素的耐药性，还可同时导致细菌对林可霉素、链阳性菌素复合物等抗生素交叉耐药，这种现象称为大环内酯、林可霉素、链阳性菌素（MLSB）耐药表型。erm基因介导的MLSB耐药表型可分为诱导型（iMLSB）和结构型（cMLSB）两种，结构型主要是由于翻译弱化系统的碱基发生改变，包括缺失、重复和点突变，使erm基因mRNA有活性，能被核糖体翻译，导致核糖体在合成时甲基化。这些菌株在诱导剂存在或不存在的情况下对MLSB类抗生素都有同等程度的耐药。诱导型erm基因mRNA被合成但构象无活性，只能被大环内酯类诱导激活。诱导型耐药体外表现为对14元环、15元环大环内酯类药物耐药，对16元环、林可酰胺类、链阳性菌素B敏感。

②主动外排机制：20世纪80年代末在对红霉素耐药的表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌研究中，发现了一种新的耐药模式，称为MS耐药表型。该耐药模式由编码主动外排系统的msrA基因介导，MsrA泵属于ATP结合盒转运（ATP－binding cassette transporter，ABC）超家族，以ATP为动力，对14元环、15元环的大环内酯药物及链阳性菌素B专一性耐药。该耐药为诱导性表达，红霉素和其他14元环、15元环的大环内酯类药物是诱导药，对链阳性菌素B的耐药仅在经红霉素诱导后产生，对克林霉素则保持敏感。msrA基因定位于质粒，能通过接合、转导、转化等方式在葡萄球菌属中水平传播，因而广泛存在。1996年链球菌属中也发现类似的耐药模式，称为M型，由主动外排基因mefA介导，主要作用底物为14元环、15元环大环内酯，而对16元环大环内酯、克林霉素和链阳菌素B敏感。MefA泵属于主要易化超家族（major facilitator superfamily，MFS），以质子泵为动力。mefA基因广泛分布于链球菌、棒状杆菌、微球菌、肠球菌等革兰阳性细菌中。2001年北美的一项调查表明，红霉素耐药的A群及B群链球菌中M表型分别占91．4%、59．1%。Canu等报道在美国和加拿大41%～85%肺炎链球菌对红霉素耐药是由mefA基因编码的主动外排系统介导的。

③核糖体突变导致的耐药：核糖体基因变异最早在幽门螺杆菌、鸟型分枝杆菌中有报道，变异主要发生在与大环内酯类药物结合密切相关的23SrRNAⅤ区、Ⅱ区及蛋白质L22及L4的高度保守序列中。23SrRNAⅤ区主要的突变位点为A2058、A2059及C2611。A2058G及A2058U突变能导致高水平MLSB耐药，与由erm基因编码导致的A2058腺嘌呤双甲基化引起的耐药类似。A2059G突变也能导致细菌对红霉素、泰利霉素、16元环大环内酯类药物的高水平耐药及对克拉霉素、克林霉素中等水平耐药，但对链阳性菌素敏感，该表型称为ML耐药型。

C2611突变使中心环单链的碱基互补结构G2057～C2611失稳，但C2611U突变对大环内酯类药物MIC值影响较弱。C2611A及C2611G突变能导致细菌对链阳性菌素B产生高水平耐药。此外，Canu等发现第2610位点C～U突变能导致大环内酯类药物及克林霉素MIC值轻微增加。另有报道表明23S rRNAⅡ区35发夹结构的第752位点腺嘌呤突变能显著影响药物的活性。核糖体蛋白L22和L4结合于23SrRNA的Ⅰ区，参与维持23SrRNA的立体构象。L4及L22突变使细菌多肽链通道发生重大变化，L4突变使入口通道变窄，不能与红霉素结合，可能降低了红霉素与靶位点的结合能力。与之相反，L22变异能扩大入口通道，通过无效途径结合红霉素。L22核蛋白体的突变发生在B发夹结构延伸的C2末端，介导链阳性菌素B耐药和低水平的大环内酯耐药，但对克林霉素无影响。细菌L4蛋白的突变发生在长度为32个氨基酸的一段高度保守序列中，一般引起MSB表型耐药。东欧国家及芬兰发现MSB耐药表型的肺炎链球菌中L4蛋白含有3个氨基酸取代，在加拿大一株临床分离株中发现6个氨基酸的插入，表现出类似的表型，对所有大环内酯类药物包括泰利霉素出现轻度耐药。由23SrRNA靶基因突变导致的耐药表型还与变异的23SrRNA操纵子基因（rrl）的拷贝数相关。变异rrl接合试验证实，rrl基因变异拷贝数增多时细菌对红霉素敏感性降低。肺炎链球菌23SrRNA存在4个拷贝的rrl基因，至少2个拷贝突变才能导致肺炎链球菌对红霉素高水平耐药。由于幽门螺杆菌及鸟结核分枝杆菌只含有1或者2个rrl基因，因此，肺炎链球菌RNA变异比幽门螺杆菌及鸟结核分枝杆菌罕见。

④灭活酶的产生：肠杆菌科细菌由ereA、ereB基因编码的红霉素酯酶或mph基因编码的大环内酯2′－磷酸转移酶，能破坏14元环大环内酯类抗生素的内酯环（但不能破坏16元环大环内酯类抗生素的结构）导致细菌对该类抗生素耐药。有报道葡萄球菌的linA／linA C基因可编码灭活林可霉素的酶，导致林可霉素及克林霉素失活。该研究同时还发现。msrA与linA基因的联合作用可能导致细菌产生类似MLS的耐药表型。此外，葡萄球菌属细菌还能通过vatA、vatB基因编码乙酰转移酶灭活链阳性菌素A，vgb基因编码内酯酶灭活链阳性菌素B，通过inuA基因介导的化学修饰使林可霉素失活。

5．喹诺酮类药物的耐药机制　随着喹诺酮类药物的广泛使用，耐药性呈蔓延趋势，耐药的细菌种类不断增多，耐药程度日趋加重。据报道，欧美多见于铜绿假单胞菌、沙雷菌、不动杆菌与MRAS，东南亚诸国除上述细菌外，还有大肠埃希菌与痢疾志贺菌，日本则以葡萄球菌与铜绿假单胞菌居多。我国喹诺酮耐药性发展尤为严重，目前几乎所有医院感染常见致病菌均可见到喹诺酮耐药菌株。革兰阳性菌对喹诺酮类药物的耐药率上升较快，特别是MRSA对环丙沙星的耐药率已达到90%～99%，对氧氟沙星也达到82%。甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌对诺氟沙星的耐药率已达50%，肠球菌对环丙沙星的耐药率达82%。革兰阴性菌对喹诺酮类药物的耐药率增长也很快，目前耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌（FREC）临床检出率达50%～70%或以上。而且院外感染与院内感染所分离菌株的耐药率无显著性差异，这与门诊患者对喹诺酮类药物的广泛使用，尤其是不合理使用有关。

1976年，Gellert等发现DNA促旋酶，观察到萘啶酸能抑制大肠埃希菌DNA促旋酶，由萘啶酸耐药菌分离出的DNA促旋酶对萘啶酸表现出耐药性，据此确认喹诺酮类药物的作用靶位为DNA促旋酶。1990年，加腾等发现大肠埃希菌拓扑异构酶能被喹诺酮类药物抑制，由喹诺酮耐药性MRSA克隆出的耐药基因之一为突变的拓扑异构酶基因，从而判明拓扑异构酶亦为喹诺酮类药物的靶位。目前认为喹诺酮类抗菌药的耐药机制主要有：①作用的靶分子——Ⅱ型拓扑异构酶变异；②细菌细胞膜通透性改变；③主动外排。

（1）Ⅱ型拓扑异构酶的变异：在大肠埃希菌中已确证存在的Ⅱ型拓扑异构酶包括两种，即DNA促旋酶和拓扑异构酶。前者促使DNA逆向超螺旋化，与DNA复制、修复、转录、重组等密切相关，后者在DNA切断、重接和复制终了后DNA双链分离等过程中起重要作用。DNA促旋酶是由gyrA基因编码的GyrA蛋白和由gyrB基因编码的GyrB蛋白质组成的四聚体，其中任一亚基变异都会引起喹诺酮耐药性。拓扑异构酶是由parC基因与parD基因分别编码的ParC蛋白与ParD蛋白各2分子组成的四聚体，其中任一亚基变异均会引起喹诺酮耐药性。有实验表明，喹诺酮类药物不能直接与DNA促旋酶或DNA单独结合，而是与DNA促旋酶－DNA复合体结合。由于DNA促旋酶发生变异，其中个别氨基酸变化使喹诺酮类药物与DNA促旋酶－DNA复合体的亲和性下降，形成耐药性。与DNA促旋酶相同，拓扑异构酶发生变异，拓扑异构酶－DNA复合体对喹诺酮类药物亲和性降低，从而出现耐药性。

（2）细菌细胞膜通透性改变：革兰阳性菌缺少细菌外膜，因而不存在膜通透性下降的耐药机制。革兰阴性菌对膜通透能力变化较大，膜孔蛋白通道非常狭窄，能对大分子及疏水性化合物的穿透形成有效屏障。革兰阴性菌细胞外膜通透性降低会阻碍抗生素进入细菌内膜靶位，由此导致细菌耐药性产生，其主要原因有：①膜孔蛋白缺失；②多向性突变；③特异性通道的突变；④脂质双层改变。

喹诺酮类药物与其他抗菌药相同，依靠革兰阴性菌外膜蛋白和脂多糖的扩散作用而进入细菌体内，外膜蛋白与脂多糖变异均可使细菌摄取药物的量减少而导致耐药。例如大肠埃希菌通透喹诺酮类药物的孔蛋白主要为OmpF与OmpC，在喹诺酮药物作用下，发生变异而缺失OmpF的菌株，药物不能进入细胞。有许多大肠埃希菌菌株既耐诺氟沙星、环丙沙星，又耐早期的非氟喹诺酮类药物，在这种情况下，药物的非渗透性阻碍了抑制细菌DNA促旋酶所必需的细胞内喹诺酮类药物的浓度，出现耐药性。另有研究表明，铜绿假单胞菌较低的外膜通透性表明膜孔蛋白孔道狭窄，其对喹诺酮类等抗生素的固有耐药性也是有效通透屏障和多重外排转运相结合的结果。

（3）主动外排：外排系统是细菌对喹诺酮类耐药的另一重要途径。细菌细胞膜上存在一类蛋白质，在能量支持下，可将进入胞内的药物选择或非选择地排出细胞外，故又称外排泵。此种外排系统亢进，使菌体内药物浓度降低而导致耐药。目前的研究认为，细菌产生的耐药性应从三个层面不断深入理解，第一层认为与抗菌药的结构和作用机制有关；第二层是由于细菌长期接触药物，引起菌体细胞膜孔蛋白的丢失，从而导致细胞通透性下降，而这引起的仅是低度耐药；第三层则是细菌细胞膜上外排泵（主动外排系统）的表达水平不断提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出细胞外，此为形成细菌的多重耐药性的主要原因。

近年来报道了大量能介导喹诺酮类药物耐药性的主动外排蛋白，如耻垢分枝杆菌的LfrA，枯草芽胞杆菌的Blt和Bmr，肺炎链球菌的PmrA，其中AcrB蛋白是大肠埃希菌的一个典型介导多重耐药性的外排泵。由喹诺酮耐药性MRSA克隆出的norA基因编码的NorA蛋白为一疏水性膜蛋白，能依赖能量将诺氟沙星、环丙沙星等亲水性喹诺酮类药排出菌体外。最新信息表明，调节基因位点也影响NorA蛋白的表达，从而导致药物的流出。细菌对外排泵的调控是一个极复杂的过程，其复杂性说明了细菌对包括抗生素在内的外界环境压力作出反应的能力。

6．其他抗菌药的耐药机制

（1）四环素类的耐药机制：细菌对四环素类药物产生耐药性的一个重要原因是由于细菌能够产生一种被称为TetM的蛋白，而这种蛋白能够保护靶核糖体免受药物的作用。

（2）利福霉素类的耐药机制：对利福霉素类药物产生耐药的葡萄球菌、肠球菌、链球菌、肠杆菌和假单胞菌等的耐药机制研究表明，由于降低了RNA聚合酶对这类抗菌药的亲和力，而导致细菌耐药。

（3）糖肽类的耐药机制：糖肽类抗菌药是治疗耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的首选药物。1996年5月，日本首次报道临床分离的对糖肽类抗菌药敏感性下降的金黄色葡萄球菌，1997年7～8月，美国报道2例临床分离的糖肽类中敏金葡球菌（GISA）。

研究者基于对GISA细胞壁、细菌生物活性研究及体外细胞壁结合万古霉素实验结果认为，GISA由于细胞壁结构改变，细胞壁中未酰化氨基酸增加，使其结合万古霉素能力增强，阻碍万古霉素进入胞质活性部位，故提出“药物捕获”机制。此外，诱导的GISA菌株PBP2的含量均比亲代多，由此推测增加的PBP2与万古霉素竞争结合肽聚糖前体的靶位，从而抑制万古霉素活性，也可能是某种基因突变导致调控基因活性增强，产生了相对分子质量为53×103的新蛋白质，改变胞壁结构而耐药，而编码PBP2的基因可能恰好位于该操纵子中，表达水平随之增强。

另外，MRSA在全球范围内广泛流行，常用万古霉素和替考拉宁治疗，推测MRSA中存在一些耐受糖肽类抗菌药物的亚群落或产生基因突变，两者可致GISA，甚至GRSA。美国临床上最早发现的2例GISA感染者均先有MRSA感染，长期反复使用万古霉素终致GISA。

抗菌药的广泛应用虽然仅仅半个多世纪，但不同病源细菌或环境细菌已经拥有了多类针对不同抗菌药的耐药保护机制，细菌本身基因结构的多样性与可移动性，使其能进化适应有抗菌药或其他毒性条件的环境。面对抗菌药的应用历史，大部分临床应用的抗菌药在1941－1968年间发现，而近40年间仅发现了3种具有新型抗菌作用机制的药物，即唑烷酮类的利奈唑胺和脂肽类的达托霉素及Platensimycin。前两者分别于2000年和2003年在美国批准进入临床应用，用于耐药金黄色葡萄球菌（包括MRSA或多重耐药株）等革兰阳性球菌感染的治疗。人类已面临着抗菌药耐药的危机。而对耐药机制进行研究，有助于新型抗菌药物的研发，也有助于从药效学角度优化药物剂量。也对严格控制抗菌药应用的紧迫性提出了警示。人类在面对细菌耐药性时，已经在一定程度上失去了与细菌的竞争力，最大限度地减低细菌耐药性与延长抗菌药物的疗效周期是人类所面临的长期挑战。而加强抗菌药合理应用在减少细菌耐药性发生中起着至关重要的作用。

（4）抗结核杆菌药物的耐药机制：结核病是严重危害人类健康的传染病，而结核多耐药菌株（MDR－TB，定义为至少耐异烟肼、利福平两种药物）的出现及全球性的传播更加剧了结核防治的困难。对抗结核一线药物的作用机制研究已取得很大进展，但仍有部分抗结核一线药物的耐药机制尚未明确。基因学研究表明，结核杆菌耐药性的产生多见于染色体上编码药物标靶的基因或与药物活性有关的酶基因突变所造成。耐药性有关的突变形式有点突变、缺失、插入，这些形式在抗结核一线药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素等）均已出现。

①异烟肼：由捷克生化学家1912年首次合成，其抗生素活性直到1951年才被发现，是结核化疗史上的里程碑。它是个前体药物，需要被异烟肼敏感的结核杆菌活化。体外实验表明异烟肼经活化后导致许多高反应性的氧化和酰化蛋白的产生，在体内的实际活性形式目前还不清楚，耐药机制也很复杂，尚有许多疑点需进一步研究。

②利福平：作用于细菌RNA聚合酶β－亚基，干扰细菌转录及合成而实现杀菌效果。96%的临床耐药菌株是由于编码该酶β－亚基的rpoB基因发生突变所致。还有其他耐药机制存在。耐利福平临床分离株同时对利福霉素的其他衍生物（如利福喷汀、利福布汀等）交叉耐药。

③吡嗪酰胺：是烟酰胺类似物，其靶标可能为脂肪酸合成系统中的酶，在体内由吡嗪酰胺酶／烟酰胺酶转换为活性形式吡嗪酸而发挥作用，能杀死半休眠期的结核分枝杆菌。根据吡嗪酰胺作用机制，对吡嗪酰胺耐药的结核分枝杆菌丧失了吡嗪酰胺酶活性。资料表明，70%～97%的耐药分离株存在由pncA突变所造成的蛋白结构改变，从而改变了酶结构，失去了将吡嗪酰胺转换成活性形式的能力，导致耐药。与耐药有关的突变广泛分布在pncA基因上。一个合理的解释为，此酶仅含有186个氨基酸，任何氨基酸取代均会引起酶结构的最终改变。进一步研究表明，对前体药物缺乏吸收也是耐药的一种重要机制，吡嗪酰胺的摄取过程是由ATP依赖性转运体系所介导，缺乏吸收是结核分枝杆菌的独特机制。

④乙胺丁醇：其作用机制有很多说法，目前较成熟的一种认为乙胺丁醇作用靶分子是阿拉伯糖基转移酶。作为阿拉伯糖类似物，与此酶结合后影响细胞壁分枝菌酸、阿拉伯半聚糖、蛋白聚糖复合物的形成而起效。与此论点一致的是结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embCAB有关，此操纵子由embC、embA、embB　3个基因组成，embB与耐药性密切相关。但也有30%耐药临床分离株未检测到embB突变，提示尚有其他耐药机制存在。

7．抗真菌药的耐药机制　随着抗真菌药在临床上的大量应用，真菌耐药性不断出现且日趋严重。真菌耐药性分固有耐药性和获得性耐药性，还有一种耐药性称为临床耐药性。临床耐药性的产生与多种因素有关，包括机体免疫功能低下、药动学因素、药物剂量不合理及致病菌自身特征等。不同的真菌，不同的药物，耐药机制不同。真菌高度耐药是多种耐药机制共同作用的结果。通过对耐药白色念珠菌的流行病学调查发现，85%的耐药株外排泵过度表达；65%和35%的耐药株为药物靶酶改变或过度表达；75%的耐药株为多因素联合耐药。真菌对药物耐药的机制如下。

（1）菌体细胞内药物积聚减少：真菌产生耐药的一个重要机制是细胞内药物浓度降低。实验测得敏感白色念珠菌细胞内唑类药物浓度是细胞外的2．5倍以上，而耐药菌株胞内仅是胞外的1／2。真菌细胞内药物累积降低，一方面是因为膜通透性降低使进入的药物减少；另一方面细胞内的药物外排增强。近期研究表明，药物外排增强为其主要原因。此机制由MDR（multidrug resistance）蛋白介导。MDR蛋白有多种，根据其功能不同，可将其分为两大类：ATP结合转运蛋白（ATP binding casstte transporters，ABCT）和易化扩散载体超家族（major facilitator superfamily，MFS）。近年来对真菌耐药性的研究多集中在这些蛋白上。念珠菌Cdr（Candida drug resistance，Cdr）基因编码的转运蛋白（Cdrp）是一种ATP结合型转运蛋白，目前至少有7个Cdr基因已完成鉴定、测序，但只发现Cdr1与Cdr2基因与唑类药物耐药有关。Cdr1p及Cdr2p通过增加药物的外排，而Mdr1p通过抑制药物摄入降低细胞内药物浓度。研究表明，耐药念珠菌中Cdr1、Cdr2和Mdr1的表达明显增强，并伴有细胞内唑类药物的降低。但在耐药菌株中并不一定同时增多。

（2）药物作用靶位改变：14α－去甲基化酶（CYP51）是唑类抗真菌药物的靶向酶。CYP51结构改变与过度表达是导致此类药物耐药的另一作用机制。CYP51是真菌麦角甾醇生物合成不可缺少的酶，在念珠菌中由Erg11基因编码。CYP51的数量和活性差别是耐药菌与敏感菌的重要区别之一。与药物作用靶位改变相关的耐药机制主要有以下几个方面。

①靶酶基因突变；靶酶基因编码区发生改变，可引起酶活性和三维结构发生改变，导致酶与药物的亲和力降低而产生耐药。通过比较唑类药物敏感株及药物诱导后的耐药株，发现靶酶基因存在等位基因的多态性，认为唑类药物耐药性的快速发展是由于涉及对靶酶突变敏感区基因杂合子向纯合子突变的选择机制，但是这种耐药表型并不稳定。

②靶酶基因过度表达：靶酶基因调控区和（或）相应的调节基因发生改变，靶酶基因过度表达，细胞内药物不能完全抑制靶酶的活性而耐药。光滑念珠菌对唑类药物耐药株Erg11基因拷贝数比敏感株多3．7倍，Erg11mRNA水平比敏感株高8倍。光滑念珠菌Erg11基因过度表达，可由体内、体外药物诱导所致。

③靶位缺乏：细胞膜中缺乏麦角甾醇的真菌变种常对多烯类药物耐药，此时真菌细胞膜中的主要甾醇成分已不是麦角甾醇。唑类抗真菌药能抑制麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜中缺乏两性霉素B结合位点，使真菌对其产生耐药性。

（3）膜甾醇合成通路发生变化：对耐唑类抗真菌药的酿酒酵母菌的基因研究表明，甾醇合成的变化与耐药有关。唑类药物与念珠菌作用后引起麦角甾醇合成受阻，麦角甾醇被4α－甲基－3，6－二醇替代，这一替代物为一细胞毒性甾醇，能干扰真菌甾醇与磷脂的整合而抑制细胞生长，如果菌体内缺乏ERG3编码的甾醇去饱和酶，会导致细胞毒性低的甾醇聚集，使唑类药物对真菌的抑制作用被对抗而产生耐药性。

（4）真菌细胞壁组成的变化：真菌对药物的敏感性不仅与膜的变化有关，还与真菌细胞壁组分的变化有关。研究报道，细胞壁组成的变化是多烯类药物耐曲霉菌的机制之一。在指数生长期的白色念珠菌，两性霉素B通过细胞壁与膜作用具有限速性，细胞壁β－葡聚糖的变化能导致耐药性的产生。另有报道，真菌细胞壁的另一组分几丁质含量低时，可诱导酵母菌耐药性的产生。

（5）真菌产生生物膜：生物膜是指微生物分泌于细胞外的多糖蛋白复合物，将自身包裹其中于生物表面形成的膜状物。膜内菌细胞的形态常与浮游菌不同，且对药物的敏感性差。研究表明，许多念珠菌感染与念珠菌在内置医疗材料（如静脉导管、尿道插管及人工合成瓣膜）上所形成的生物膜有关，且这些膜内真菌常表现出高度的耐药性。其耐药机制可能与膜内真菌生长速率慢、胞外聚合物基质所形成的膜屏障作用、表面诱导性耐药基因的表达等因素相关。